r6o1og
Existenta tuturor organismelor vii este conditionata de activitatea unor mecanisme de rezistenta si de imunitate, capabile sa protejeze individualitatea lor chimica, prin mecanisme de recunoastere si diferentiere a substantelor proprii (seif) de cele straine (nonself). In mod normal, aceste mecanisme sunt perfect tolerante fata de moleculele seif, dar se activeaza si reactioneaza mai mult sau mai putin viguros pentru a indeparta, a neutraliza sau a distruge substantele nonself.
Mecanismele de rezistenta si imunitate sunt prezente pe toata scara evolutiva a organismelor, incepand cu bacteriile si se complexeaza in evolutie.
Celulele bacteriene poseda mecanisme de protectie a individualitatii genetice, reprezentate de:
-fenomenele de restrictie mediate de prezenta unor sisteme enzimatice specifice (enzime de restrictie), care recunosc moleculele straine de ADN, le cliveaza la nivelul unor situsuri specifice, rezultand fragmente mai mici, sensibile la actiunea exo- si endonucleazelor;
-fenomenele de reparatie genetica dependente de activitatea unor sisteme enzimatice care recunosc modificarile ADN induse de mutatii sau de lipsa de fidelitate a mecanismelor de replicare, transcriere si traducere genetica, corectandu-le fie complet (sistemele error free) sau minimalizand erorile in cazul sistemelor reparatorii predispuse la erori (error prone systems).
La plantele superioare, mijloacele de aparare specifica, aparent sunt absente, dar exista o gama larga de modalitati de aparare nespecifica:
-continuitatea si integritatea tesuturilor epidermice, acoperite sau impregnate cu substante impermeabile pentru virusuri si microorganisme;
-rezistenta fiziologica conferita de continutul inalt de zaharuri reducatoare, prezenta taninurilor, a diferitilor acizi organici, a pseudoanticorpilor cu activitate hemaglutinantain sucurile vegetale.

La protozoare, procesele de recunoastere asigura selectia hranei, identificarea partenerilor pentru conjugare la parameci, iar la cele parazite, procesele de recunoastere mediaza interactiunea cu gazda.
Mecanisme de aparare la nevertebrate
Desi nu au sistem limfoid, nevertebratele recunosc si raspund la substantele nonself, la fel de eficient ca si vertebratele. La ele functioneaza o diversitate de mecanisme, unele fiind inductibile. Raspunsul este de scurta durata si nu are specificitate fata de agentul infectios patogen. Raspunsul imun al nevertebratelor se aseamana calitativ cu cel inascut al vertebratelor mediat de celulele fagocitare si de moleculele neimunoglobulinice.
La nevertebrate, apararea organismului este asigurata de bariere fizico-chimice complexe: secretia mucoasa care acopera corpul celenteratelor, anelidelor, molustelor si protocordatelor, omoara potentialii patogeni. Exoscheletul dur al celenteratelor, molustelor, artropodelor, echinodermelor si protocordatelor, formeaza o bariera protectoare eficace fata de agentii infectiosi. Majoritatea nevertebratelor superioare au sistem circulator cu celule albe, denumite hemocite sau celomocite, in functie de natura cavitatii corpului. Lipsesc hematiile.
in mediul intern al nevertebratelor se gasesc fagocite, factori antimicrobieni constitutivi si inductibili cu efect neutralizam si litic, factori de coagulare a macromoleculelor straine. Toate nevertebratele, chiar cele care nu au cavitati ale corpului (spongieri, anemone, viermi lati), au fagocite, uneori de mai multe tipuri. Ca si la vertebrate, fagocitele sunt efectorii raspunsului inflamator, sintetizeaza enzime lizosomale si poseda mecanisme citocide dependente de superoxid.
Reactiile de aparare (repararea tisulara, fagocitoza, reactia de incapsulare)sunt mediate de fagocite si de celulele hemostatice. Ingestia microorganismelor invadatoare este rezultatul actiunii fagocitelor, iar un numar mare de microorganisme si de metazoare parazite este incapsulat de celulele hemostatice si de tip fagocitar. Endoparazitul care patrunde in organismul nevertebratelor este fagocitat, sau daca are dimensiuni prea mari, este incapsulat, incapsularea este rezultatul unei fagocitoze fruste. Adeseori, endoparazitul incapsulat, este omorat sub actiunea intermediarilor toxici ai unei cascade enzimatice.
La nevertebrate lipsesc limfocitele si moleculele de imunoglobuline, dar acestea sunt compensate de o varietate de factori umorali de aparare: aglutinine, lizozim, bactericidine, enzime lizosomale, factori de imobilizare. La insecte s-au detectat peste 15 tipuri de proteine antibacteriene inductibile in cateva ore dupa injectarea unui antigen.
Nevertebratele nu au proteinele cascadei complementare, dar viermii, insectele, crustaceii contin sistemul profenoloxidazei. Componentele acestui sistem sunt activate de o serie de enzime. La capatul cascadei de activare se formeaza enzima activa fenoloxidaza, cu rol esential in indepartarea substantelor nonself.
Fagocitoza este foarte activa si este stimulata de aglutininele si bactericidinele cu rol de opsonine. Din punct de vedere functional, aglutininele si bactericidinele sunt similare anticorpilor. Acestea sunt lectine, cu rolul de a lega componenta glucidica a glicoproteinelor de pe suprafata celulelor nonself, rezultatul fiind aglutinarea.
Lectinele sunt molecule care au aparut timpuriu in evolutie si sunt ubicvitare: se gasesc la bacterii, plante, nevertebrate si vertebrate. Ele tapeteaza microorganismele invadatoare si au rolul de a le imobiliza, dar au si rol opsonizant, usurand fagocitoza. In functie de specificitatea lor de legare cu glucidele, lectinele sunt foarte diferite.
in corpul gras al insectelor superioare s-au caracterizat circa 100 de peptide antimicrobiene, a caror sinteza rapida este indusa de infectie. Din punct de vedere structural sunt de doua tipuri:
-peptide ciclice, care contin punti S-S (de exemplu, drosmycina), active fata de bacteriile Gram pozitive si fata de fungi;
-peptide lineare (cecropine bogate in Gly si Pro), active fata de bacteriile Gram negative.
Componentele celulare si humorale cu functii protectoare mediaza reactii de aparare nespecifice (inascute), fara raspuns accelerat la stimularea antigenica secundara.
ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUNITAR LA VERTEBRATE
La vertebrate, apararea este asigurata de mecanisme complicate celulare si humorale, de rezistenta si imunitate. Functia esentiala a sistemelor de aparare este protectia fata de agentii patogeni invadatori. Interactiunea permanenta cu microorganismele are un rol hotarator in dobandirea complexitatii structurale si functionale a sistemului imunitar. Dovada o constituie faptul ca la animalele germ-free (axenice), numarul limfocitelor B si titrul anticorpilor serici naturali sunt de 5-10 ori mai mici decat la organismele conventionale. Evolutia a generat tipuri celulare specializate, tot mai eficiente functional, care neutralizeaza, sechestreaza, omoara sau indeparteaza agentii infectiosi.
La vertebrate, reactiile de aparare sunt rezultatul actiunii unor factori humorali nespecifici (complement, substante bactericide) si specifici (anticorpi) si a unor populatii de celule specializate, cu actiune nespecifica (fagocite) sau specifica (limfocite).
Din punct de vedere structural, in conceptia moderna, sistemul imunitar al organismelor superioare este considerat ca un organ difuz sui-generis, alcatuit dintr-un numar foarte mare de molecule si celule, reunite intr-o retea de interactiuni complexe, a carei functie este asigurarea integritatii si individualitatii structurale a organismului.
in conceptia restrictiva a lui N.K. Jerne, sistemul imunitar este reprezentat in exclusivitate de limfocite, iar intr-o acceptiune mai larga, pe langa limfocite, in alcatuirea sistemului imunitar intra o serie de celule accesorii cu rol esential in declansarea raspunsului imun: macrofagele si o serie de celule inrudite(ce\u\e\e Lagerhans din tegument, celulele dendritice si cele interdigitate).
Se apreciaza ca numarul limfocitelor, la adultul normal, este de 1012, iar al moleculelor de imunoglobuline, de ordinul a 10 20. impreuna, aceste componente formeaza organul difuz, cu greutatea de circa 910 g (1-2% din greutatea corpului), a carui existenta este adeseori ignorata, datorita caracterului sau difuz, in tot organismul. Celulele si moleculele sistemului imunitar sunt prezente in toate tesuturile, dar in unele organe (splina, ganglioni limfatici, placi Peyer, amigdale, timus), componentele celulare au o densitate maxima.
Sistemul imunitar este unul din cele mai complexe ale organismului. Complexitatea lui deriva din structura de retea complicata de comunicatii intercelulare, din ubicvitatea sa in organism si din efectele multiple pe care le determina un numar mic de categorii celulare. Sistemul imunitar este considerat un adevarat "creier mobil".
Din punct de vedere structural si functional, sistemul de aparare al organismelor superioare prezinta numeroase dualitati:
-existenta unui compartiment al rezistentei nespecifice si neadap-tative (inascuta) si a unui compartiment cu actiune specifica si adaptativa (sistemul imunitar);
-prezenta a doua populatii inclinate de limfocite (T si B), care mediaza imunitatea celulara si respectiv humorala;
-activitatea limfocitelor este modulata fie stimulator, fie inhibitor, sub actiunea unor celule si a unor factori humorali;
-existenta organelor limfoide centrale (primare) si periferice (secundare);
-existenta unui raspuns imun primar si a unui raspuns imun secundar,
-dualitatea structurala (doua perechi de catene polipeptidice) si functionala (bivalenta) a moleculei de anticorp;
- comportamentul dublu al moleculei de anticorp: molecula de anticorp recunoaste epitopul specific si la randul ei este recunoscuta de molecule cu rol receptor.
Numarul celulelor sistemului imunitar (cu un ordin de marime superior neuronilor) si al moleculelor sale nu reflecta fidel potentialul de aparare a organismului, deoarece in cursul raspunsului imun are loc proliferarea si amplificarea numerica a limfocitelor, precum si a potentialului de biosinteza. La aceasta se adauga o rata inalta de reinoire si refacere a rezervelor sale celulare.
La om se produc zilnic un miliard de limfocite ce trec in circulatie. Circuland si recirculand prin reteaua vaselor sanguine si limfatice, celulele si moleculele sistemului imunitar asigura supravegherea organismului, recunoasterea moleculelor si a celulelor nonself, pentru a le elimina.
Limfociteie
Sistemul imunitar este reprezentat de tesuturi derivate din mezoderm, a caror principala componenta celulara este limfocitul. De aici deriva denumirea de sistem limfoid. In ultimul timp se foloseste denumirea de "limfon", care semnifica totalitatea organelor limfoide -primare si secundare, precum si celulele componente cu functia de a recunoaste antigenul.
Limfociteie sunt celule care in cursul elaborarii raspunsuiui imun, recunosc specific antigenul si de aceea se mai numesc imunocite. De aici deriva denumirea de sistem imunocitar, echivalenta celei de sistem limfoid. Toate celulele acestui sistem poarta pe suprafata lor, molecule cu rol receptor, capabile sa recunoasca specific determinantii antigenici straini.
Sistemul imunitar functioneaza pe baza interactiunii dintre semnal (antigen) si receptorul specific limfocitar preformat.
in conceptia moderna, limfocitul este celula centrala a sistemului imunitar. Ea nu este celula "cap de serie" - asa cum o considerau vechii histologi, ci prezinta o extraordinara capacitate de reactivitate si diferentiere.
Numarul limfocitelor. Copiii au un numar mai mare de limfocite si de aceea varsta trebuie considerata ca un parametru fiziologic de variatie, in evaluarea numerica a acestor celule. Ele reprezinta 25-33% din totalul leucocitelor, adica circa 2100 celule/mm 3 de sange. Valori mai mici de 1500 Iimfocite/mm3 semnifica starea de limfocitopenie si cel mai adesea semnifica un deficit numeric al limfocitelor T.
Pana in anii '50, limfociteie erau distinse numai dupa dimensiuni: mari, mijlocii si mici. Cele mai multe limfocite circulante au dimensiuni mici: 7-10 |am diametru. La microscopul optic, pe frotiul colorat May Grunwald - Giemsa, limfociteie se disting de celelalte dupa dimensiuni, sunt agranulare si au cel mai mare raport nucleocitoplasmatic. Limfociteie mari au un raport nucleocitoplasmatic mai mic si in citoplasma se gasesc granulatii azurofile. Se numesc limfocite granulare mari (LGL). In vitro, limfocitele sunt neaderente si nu fagociteaza.
Astazi, Imunologia are la baza conceptul unei heterogenitati functionale nelimitate a limfocitelor, care deriva din diversitatea specificitatii receptorilor suprafetei lor.
Populatia de limfocite care are receptori identici de antigen si recunoaste un singur epitop (sau cativa inruditi) formeaza o dona. Toate celulele unei clone sunt descendente ale unei singure celule-mama. In consecinta, in organism sunt tot atatea clone de limfocite, cate tipuri de determinanti antigenici exista (teoretic) in natura. Corespondenta complementaritatii spatiale dintre receptorii limfocitari de antigene si epitopii antigenici asigura posibilitatea elaborarii unui raspuns imun specific, dupa contactul limfocitelor cu oricare dintre epitopi.
Caracterizarea functionala a limfocitelor este rezultatul cercetarilor intreprinse dupa anul 1960. in raport cu organul limfoid primar in care se produce diferentierea si maturarea, Roitt si col. (1966) au impartit limfocitele in doua categorii distincte;
-limfocite T, care se diferentiaza si se matureazain timus;
-limfocite B, care se diferentiaza si se matureaza in bursa lui Fabricius la pasari si in echivalentii ei functionali, la mamifere.
in functie de capacitatea lor de a interactiona cu antigenul specific, limfocitele sunt:
-incompetente (imature), cele care nu recunosc antigenul;
-competente (mature), cele care recunosc antigenul specific.
Starea de competenta este conditionata de prezenta receptorilor prin intermediul carora antigenele sunt recunoscute. Pe suprafata unei celule pot fi pana la 100 000 de molecule receptoare identice, care asteapta intalnirea cu substantele nonself corespunzatoare.
Dupa ce limfocitul si-a dobandit competenta in unul din organele limfoide primare, poate sa ramana in repaus, daca organismul nu a receptionat mesajul antigenic corespunzator. Aceste limfocite sunt neangajate (neinformate sau naive). Cele care au venit in contact cu antigenul specific sunt limfocite angajate (informate). Ele constituie substratul material al memoriei imunologice si ori de cate ori se vor reintalni cu antigenul, vor produce un raspuns imun rapid si amplu.
Dupa durata vietii, limfocitele sunt:
-cu viata scurta (efectoare ale raspunsului imun);
-cu viata lunga (de memorie). Ele recircula in organism perioade indelungate (de ordinul anilor). La om, limfocitele de memorie ar supravietui circa 10 ani, fara sa se divida.
in raport cu functia pe care o indeplinesc, se disting urmatoarele categorii de limfocite:
-efectoare, cele care direct sau indirect, prin molecule efectoare, neutralizeaza antigenul;
-reglatoare, cele care ralizeaza echilibrul optim al raspunsului imun.
Limfocitele B
Limfocitele B reprezinta 5-15% din totalul limfocitelor circulante si constituie o diviziune functionala majora a populatiei limfocitare. impreuna cu descendentii lor diferentiati (limfoblastul, plasmocitul), limfocitele B sintetizeaza anticorpi, efectorii raspunsului imun mediat humoral (RIMH).
Limfocitul B imunocompetent (matur, neangajat) sintetizeaza cantitati mici de molecule ale unui izotip de imunoglobuline, care raman legate de membrana limfocitului, avand rol de receptori de antigen, adevarate "antene" de detectare a antigenului specific.
Sub aspectul specificitatii de legare a antigenului, fiecare organism poseda milioane de clone de limfocite B, adica mici populatii celulare identice, descendente din aceiasi celula mama, care recunosc si leaga acelasi antigen si produc anticorpi cu aceiasi configuratie spatiala a situsului de combinare.
Dupa activare, toti descendentii limfocitului B sintetizeaza imunoglobuline si le secreta ca anticorpi, cu aceiasi specificitate de legare pe care a avut-o receptorul.
Receptorul de antigen al limfocitelor B. Majoritatea limfocitelor B umane din sangele periferic exprima doua izotipuri de imunoglobuline pe suprafata lor: IgM si IgD sau numai IgD. Situsurile de legare ale celor doua izotipuri sunt identice. Numai 10% dintre limfocitele B au pe suprafata lor, ca receptor de antigen, molecule de IgG, IgA sau IgE. Cele care au ca receptor molecule de IgA, sunt localizate in tesutul limfoid asociat mucoaselor.
Moleculele receptoare de imunoglobulina sunt inclavate cu capatul
C-terminal in membrana. Intre IgM legat de membrana (IgMm), cu functia de receptor de antigen si IgM seric (IgMs), sunt doua deosebiri majore:
-IgMm contine o secventa C-terminala hidrofoba, prin care se ancoreaza in membrana limfocitelor mature neangajate, care nu au venit in contact cu antigenul;
- IgMm este monomer, iar IgM seric este pentamer.
Secventa C-terminala a IgMm cuprinde 25 de aminoacizi hidrofobi ce formeaza domeniul transmembranar, urmat de o secventa cationica Lys-Val-Lys. Ca la toate proteinele ancorate in membrana, acest domeniu formeaza un a-helix, cu o lungime suficienta pentru a strabate membrana. Fiind hidrofoba, secventa de aminoacizi are interactiuni stranse cu lipidele membranei. Secventa cationica se extinde in citoplasma, marind gradul de stabilitate a moleculei in membrana celulara.
Dupa stimularea antigenica, sinteza se comuta la IgM seric. Trecerea de la IgMm la IgMs este rezultatul unor diferente ale modului de prelucrare a ARN premesager. Copia de ARN premesager pentru sinteza catenei n(H) are doua situsuri potentiale de clivare si atasare a resturilor de poli-A, ce marcheaza capatul ARNm. Dupa stimularea antigenica, din ARN premesager sunt clivate secventele codificatoare ale domeniului C-terminal hidrofob si se sintetizeaza molecule de IgM fara secventa C-terminala de aminoacizi hidrofobi.
Comutarea IgMm — IgMs nu modifica lantul L al moleculei. Cele doua forme ale IgM au domenii identice VH si VL, adica au aceiasi specificitate de legare a antigenului (au acelasi idiotip).
Limfocitul B are receptori membranari pentru substantele mitogene, pentru complement (C3b), pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor, pentru insulina etc. Receptorul pentru C3b functioneaza si ca receptor pentru virusul Epstein-Barr. Limfocitele B neactivate au receptori de mica afinitate pentru IL-2, dar dupa stimularea antigenica, ele exprima rapid, receptori pentru IL-2 de inalta afinitate. Limfocitele B raspund la efectul stimulator al IL-2, prin proliferare rapida si secretia IgM. Pe suprafata limfocitelor B se gasesc la densitate inalta, moleculele CMH II.
Limfocitele T
Limfocitele T reprezinta pana la 80% din totalul limfocitelor circulante. Valorile normale in sange, pentru limfocitele T sunt cuprinse intre 1620-4320/mm3, intre una si 18 luni de viata si intre 590-3090/mm3, dupa 18 luni.
Proportia limfocitelor T se poate determina prin metoda rozetelor cu hematii de berbec sau prin metoda imunofluorescentei cu anticorpi monoclonali fata de receptorul de antigen.
Limfocitele T mature exprima markerul CD4** sau CDs- Aceste molecule apartin suprafamiliei imunoglobulinelor. Celulele CD 4 au de obicei functie helper, iar cele ce exprima markerul CDq sunt citotoxice.
Limfocitele T indeplinesc functii complexe, atat efectoare ale raspunsului imun mediat celular cat si reglatoare, prin intermediul unor factori humorali pe care-i secreta, denumiti limfochine. Limfocitele T realizeaza urmatoarele functii:
- lizeaza celulele care exprima molecule nonself pe suprafata lor;
- regleaza raspunsul imun;
- mediaza reactiile de hipersensibilitate intarziata.
Aceste functii sunt rezultatul heterogenitatii functionale si se datoreaza activarii unor subpopulatii distincte de limfocite T:
-limfocite Te (Tel, citotoxice sau citolitice) exprima pe suprafata lor markerul Ts (CDs);
-limfocite Th (helper) au pe suprafata markerul CD 4. Acestea sunt cele mai numeroase, reprezentand 60-65% din numarul total de limfocite T ale organismului uman;
-limfocite Ts (supresoare), purtatoare ale markerului CD 4;
-limfocite Tq sau Tqh (cfelayed /Typersensitivity) exprima markerul CDs Functiile limfocitelor Th se realizeaza prin intermediul limfochinelor secretate. In functie de limfochinele pe care le sintetizeaza, limfocitele Th se clasifica in doua subseturi:Th-1 si Th-2.
Celulele Th-1 (Th-c) secreta IFN gama, IL-2 si TNF beta (citochine de tip 1, stimulatoare ale imunitatii mediate celular). Citochinele de tip 1 produc urmatoarele efecte: stimuleaza reactia de citotoxicitate si inflamatorie asociata cu reactiile de hipersensibilitate intarziata. In esenta, limfocitele Th-1 au rol in edificarea unui raspuns imun mediar celular (RIMC).
Celulele Th-2 (Th-b) secreta citochine de tip 2: IL-4, IL-5, IL-6 si IL-10 (dar nu secreta II-2) si stimuleaza activitatea limfocitelor B de memorie. Citochinele tip 2 (IL-4, IL-5) stimuleaza raspunsul imun humoral fata de parazitii extracelulari (stimuleaza diferentierea limfocitelor B spre plasmocit) si instalarea starilor alergice prin capacitatea lor de a induce sinteza IgE si de a stimula mastocitele. In esenta, limfocitele Th-2 sunt implicate in edificarea raspunsului imun mediat humoral (RIMH). Prin toate aceste efecte, limfocitele Th sunt amplificatoare ale raspunsului imun
Limfocitele CDg (T citototoxice) reprezinta 25-35% dintre limfocitele T circulante. Functia lor consta in efectul litic prin contact celular direct asupra celulelor infectate cu virusuri, malignizate sau alogenice.
Limfocitele Tp sunt mediatoare ale reactiilor de hipersensibilitate intarziata (cfelayed) de tip tuberculinic. Ele secreta limfochine cu efecte locale asupra macrofagelor si limfocitelor din focarul inflamator.
Limfocitele Ts sunt inhibitoare ale amplitudinii raspunsului imun, dupa epuizarea antigenului. Ele au rolul de a diminua intensitatea RIMC si RIMH, mentinand in limite fiziologice intensitatea reactiilor imunitare. Se pare ca isi exercita rolul supresor asupra raspunsului imun, prin inhibarea activitatii limfocitelor Th, dar au si efect supresor direct asupra limfocitelor T si B efectoare. Limfocitele Ts au rol important in inducerea starii de toleranta fata de antigenele exogene, ca si fata de moleculele seif. Deficientele functionale ale limfocitelor Ts creeaza predispozitii pentru maladiile autoimune.
Distinctia functionala intre limfocitele TCD4 si TCDs nu este totdeauna neta. Unele clone de limfocite TCD4 au proprietati citotoxice, iar unele clone TCDs, dupa contactul cu antigenul, prolifereaza si secreta limfochine, ca si limfocitele TCD4.
Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT)
Desi moleculele de anticorpi au fost printre primele a caror structura chimica s-a identificat, caracterizarea biochimica a receptorului de antigen al celulelor T s-a facut foarte greu, deoarece nu a existat un echivalent celular T al tumorilor de mielom. Molecula cu rol de receptor de antigen a limfocitelor T s-a identificat recent, dupa ce a fost posibila cultivarea liniilor de hibridom de celule T.
Moleculele receptoare de antigen ale limfocitelor T au o larga variatie biochimica, corespunzatoare specificitatii de legare a spectrului foarte larg de antigene.
Ca si in cazul anticorpilor, pentru receptorul de antigen al celulelor T, se foloseste termenul de "idiotip" (Ti), pentru a desemna o molecula a RCT cu un set unic de epitopi asociati, derivati din configuratia sa spatiala unica, complementara pentru legarea specifica a unui epitop antigenic.
Pentru izolarea si identificarea receptorului Ti s-au utilizat anticorpi monoclonali (AMC) anti- Ti, care precipita specific moleculele Ti dintr-un amestec complex de proteine membranare. Examinarea peptidelor in imunoprecipitatele diferitelor clone de celule T, prin metoda electroforezei in SDS-poliacrilamida, a evidentiat ca RCT este un heterodimer si consta dintr-o glicoproteina de 80-90 kD, care in conditii reducatoare se disociaza in doua peptide de 40 si respectiv 43 kD. Molecula intreaga consta dintr-o pereche de lanturi peptidice, similare ca dimensiuni, legate prin punti S-S.
Cele doua peptide sunt distincte si s-au notat a si p. Lantul a are 248 aminoacizi, cu punctul izoelectric la pH = 5,0-5,5. Lantul p are 282 aminoacizi, iar punctul izoelectric este la pH 6,5-7,0.
Fiecare catena are 4 domenii: unul variabil (V a, respectiv V p), unul constant (C a, respectiv C P), unul transmembranar si unul intracitoplasmatic. Astfel alcatuita, molecula RCT face parte din suprafamilia moleculelor imunoglobulinice. Prin dimensiuni se aseamana cu lantul L al imuno-globulinelor: domeniul variabil al fiecarui lant are 110 aminoacizi, dar pentru ca se ancoreaza in membrana, se aseamana cu lantul H.
Domeniile variabile (a si P) sunt extrem de variabile (ca si regiunile variabile ale celor doua catene ale imunoglobulinelor) si participa la formarea situsului de combinare al RCT.
Situsul de combinare al RCT este alcatuit din regiunile hipervariabile sau regiunile determinante de complementaritate -RDC (3 ale catenei a si 4 ale catenei p) si este aplatizat, adaptat functiei sale de a lega suprafata aplatizata a moleculelor CMH.
La om, RCT heterodimer este asociat cu molecula T3, o grupare de trei peptide asociate necovalent. Functia probabila a lui T3 este aceea de transductor al semnalului de activare, de la Ti la citoplasma, constituind, prin modificari conformationale, un canal de trecere a ionilor de Ca2+ prin membrana, dupa ce receptorul a legat epitopul specific.RCT-1 au un repertoriu restrans de interactiune cu antigenui, dar nu manifesta fenomenul restrictiei CMH. Limfocitele RCT-2 exprima CD4 sau CDs, care determina recunoasterea antigenului asociat cu moleculele CMH II sau CMH I. Limfocitele TCR-2+
CD4+ sunt divizate pe baza limfochinelor pe care le secreta, in subseturi de celule
Th1 (stimulatoare ale IMC) si Th2 (stimulatoare ale IMH) (dupa Roitt, 1997).
- RCT-2 este heterodimerul format din polipeptidele a si p, legate prin punti S-S, prezent pe suprafata a circa 90% dintre limfocitele T;
- RCT-1 este asemanator structural cu RCT-2, dar consta din polipeptidele y si 8, cu o alta specificitate antigenica, identificata prin intermediul anticorpilor monoclonali. Se gaseste pe suprafata a 0,5-15% dintre limfocitele T circulante umane, dar este mai frecvent pe limfocitele intraepiteliale ale mucoasei intestinale.
Limfocitele T y/8 exprima markerul CD3 si recunosc antigenul printr-un mecanism asemanator cu acela al limfocitelor T a/p, adica recunosc epitopii asociati cu moleculele CMH I si II, dar frecvent par sa interactioneze cu molecule CMH neclasice, iar specificitatea interactiunii lor cu epitopii antigenici este limitata. Aceste limfocite pot sa recunoasca antigene neconventionale, ca de exemplu, proteinele de soc termic si antigenele nepeptidice (glucidice).
in general, limfocitele cu RCT-1 (y/8) sunt negative pentru markerul CD4 si pentru CDs, desi unele exprima nivele scazute ale unuia dintre markeri.
Unele studii sugereaza ca aceste celule contribuie la raspunsul initial al gazdei, la diferiti agenti infectiosi: virusuri, bacterii(in special micobacterii), paraziti, dar si la raspunsul anti-tumoral. Ele par sa constituie "prima linie de aparare". Ipoteza este in acord cu localizarea lor anatomica, la poarta de intrare in organism, in tesuturile nelimfoide (tegument, intestin), dar si in situsurile inflamatorii. Limfocitele T y/8 se aglomereaza in focarele inflamatoare cronice(membrana sinoviala, leziunile asociate cu lupusul eritematos diseminat).
La rumegatoare, 30-80% din totalul limfocitelor T circulante au receptor y/8, valorile maxime inregistrandu-se la organismele nou-nascute. La alte specii, numarul acestor limfocite T este mic. Abundenta lor numerica la rumegatoare este corelata, probabil, cu bacteriemia masiva care insoteste procesul digestiv.
in esenta, markerii RCT si CD3 sunt definitorii pentru limfocitele T.
Limfocitele T au un marker distinctiv pe suprafata lor, fata de limfocitele B: Thy 1 (CD90). Acest marker poate fi exprimat si pe alte tipuri celulare si lipseste la o mica proportie a limfocitelor T.
Celulele NK
Celulele NK (natural killer) reprezinta circa 15% din totalul limfocitelor sanguine. Ele deriva din maduva osoasa si au origine comuna (acelasi progenitor), ca si celulele T. In vitro, sunt neaderente si nefagocitare, ceea ce le aseamana cu limfocitele. Din punct de vedere morfologic, celulele NK sunt mari, granulare (LGL, /arge granular /ymphocytes), avand citoplasma mai bogata decat celelalte limfocite, cu granulatii azurofile.
Celulele NK nu au nici unul din receptorii de antigen caracteristici limfocitelor T sau B si de aceea au fost denumite celule "nule".
Celulele NK au pe suprafata lor unii markeri caracteristici limfocitelor: au receptor pentru Fc y de mica afinitate, formeaza rozete E, au receptor de mica afinitate pentru IL-2, produc IL-2 si IFN y. Au si receptori caracteristici seriei mieloide.
in dezvoltarea lor, celulele NK nu sunt dependente de timus.
Celulele NK au viata scurta si reprezinta o linie importanta, primordiala in evolutie, cu rol esential in mecanismele de aparare inascuta a organismului: sunt active in respingerea grefelor si a celulelor modificate sub raport antigenic. Functia celulelor NK este de a recunoaste si de a liza anumite celule tumorale si celule infectate cu virusuri. Celulele NK au lizat celulele liniilor B limfoblastoide transformate de EBV, deficiente in molecule CMH I, dar nu au mai lizat aceste tinte dupa transfectia cu genele HLA-B sau HLA-C. Mecanismul recunoasterii celulelor purtatoare de molecule nonself nu este cunoscut. Se admite ca celulele NK recunosc moleculele CMH si se activeaza cand receptorii lor nu intalnesc moleculele CMH pe suprafata celulelor tinta sau cand moleculele CMH au o densitate mai mica decat cea normala. Efectul interactiunii este liza celulei tinta.
Actiunea definitorie a celulelor NK este citotoxicitatea. Ele lizeaza fara restrictie CMH, celulele tumorale sau pe cele infectate cu virusuri.
Activitatea celulelor NK este foarte inalta la soarecele nud (fara timus) sau la soarecii timectomizati neonatal. Dupa activare, celulele NK elibereaza IFN y.
Cel mai studiat receptor membranar al celulelor NK este receptorul de mica afinitate pentru Fc al IgG (CD 16).
O subpopulatie distincta a celulelor NK o reprezinta celulele K (killer). Ele sunt tot LGL, dar spre deosebire de celulele NK, exprima receptorul de mare afinitate pentru Fc y. Actiunea lor principala este citotoxicitatea mediata de anticorpi (ADCC), fata de celulele modificate antigenic.
In vitro, limfocitele T din sange, sub actiunea stimulatoare a unor denumite LAK (/ymphokine activated /cillers). In vitro, prin adaugarea IL-2 si a antigenului tumoral, devin citotoxice fata de celulele tumorale omologe.
Bazele genetice ale diversitatii receptorilor de antigen
Functia imunitara se bazeaza pe interactiunea specifica dintre receptorii limfocitari si epitopii nonself. Diversitatea specificitatii de legare a receptorilor limfocitari este paradigma pe care se cladeste intregul edificiu al stiintei imunologice. Diversitatea receptorilor caracterizeaza ambele populatii de limfocite.
Limfocitele B ale vertebratelor sintetizeaza anticorpi cu o mare diversitate a specificitatii situsului de combinare (10 8- irj9 tipuri diferite, care leaga un numar echivalent de epitopi antigenici diferiti). intelegerea determinismului genetic al acestei uriase diversitati a intarziat mult fata de alte aspecte ale functionalitatii sistemului imunitar.
Prima teorie moderna cu privire la specificitatea anticorpilor a fost teoria "lanturilor laterale" a lui Ehrlich (1900). Lanturile laterale sunt receptori preformati, inserati in membrana limfocitelor
Legarea antigenului pe receptorul membranar al limfocitului va stimula celula sa sintetizeze molecule identice cu receptorul de antigen, care trec in ser ca anticorpi. Aceasta teorie a anticipat teoria selectiei clonale, precum si ideea ca sistemul imunitar poate genera receptori cu mult inainte de a veni in contact cu antigenul. Receptorii limfocitari sunt preformati, au o structura asemanatoare cu aceea a anticorpilor serici si raman in asteptarea intalnirii cu antigenul specific. Ehrlich considera, insa, in mod eronat, ca o celula poseda receptori pentru mai multe antigene. Teoria a fost abandonata cand Landsteiner a aratat ca sinteza anticorpilor este indusa si de antigenele artificiale (conjugate haptena-proteina), neintalnite niciodata in natura si astfel specificitatea anticorpilor a fost explicata prin teoriile instructive (Breinl si Haurovitz, 1930). Aceste teorii atribuiau un rol important gruparilor determinante de specificitate. Epitopii ar patrunde in celula care sintetizeaza anticorpi si ar actiona ca matrita, imprimand polipeptidelor in curs de sinteza, o configuratie spatiala complementara.
Teoriile instructive au fost infirmate dupa evidentierea diversitatii enorme a moleculelor de anticorpi, care se sintetizeaza dupa stimularea cu un antigen, precum si de faptul ca o celula B si descendentii ei produc anticorpi cu o specificitate unica fata de un epitop.
in 1959, Mc Farlane Burnet a formulat teoria selectiei clonale, care postuleaza ca sistemul imunitar este reprezentat de un numar urias de clone de limfocite, corespunzator unui numar echivalent de epitopi. Clona este o populatie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule de origine. Diversitatea clonelor este reflectata in specificitatea fiecareia de a recunoaste un anumit epitop si este generata in timpul diferentierii celulelor limfoide din celulele de origine. Toate celulele unei clone poarta pe suprafata lor, molecule identice de imunoglobulina, care functioneaza ca receptori specifici de antigen. Dupa interactiunea cu antigenul, molecula receptor va fi sintetizata si secretata, cu o rata foarte inalta, ca anticorp. Epitopii antigenici selectioneaza din aceasta colectie imensa, clonele de limfocite care au receptori complementari din punctul de vedere al configuratiei spatiale si determina proliferarea si diferentierea lor in celule producatoare de anticorpi. Toate celulele clonei au aceiasi specificitate pentru antigen.
Sistemul imunitar functioneaza pe principiul "gata facut", adica receptorul de antigen preexista pe suprafata limfocitelor, astfel incat problema diversitatii anticorpilor trebuie explicata pe baze genetice.
Teoria selectiei clonale este argumentata de cateva dovezi experimentale:
-limfocitele imunocompetente au specificitati distincte pentru diverse antigene: de exemplu, numai 1-2% dintre limfocite leaga albumina serica bovina. Numarul celulelor care leaga un anumit antigen creste mult dupa imunizarea cu antigenul respectiv;
-limfocitele unei clone au receptori si produc anticorpi cu o singura specificitate, fata de un singur epitop. Faptul ca initial se sintetizeaza IgM si ulterior IgG, nu este un contraargument, deoarece anticorpii celor doua clase au regiuni variabile identice si au aceiasi specificitate de legare cu epitopul;
-dona de celule cu specificitate de legare a unui epitop se poate elimina selectiv prin pasajul celulelor pe o coloana de afinitate, cu bile de sticla tapetate cu antigenul specific. Celulele care au receptori pentru antigen adera de coloana, iar celelalte trec, ceea ce denota ca limfocitele sunt angajate sa raspunda la un antigen, inainte de a se intalni cu el, prin receptorii lor specifici preformati;
-incubarea limfocitelor cu un antigen puternic radiomarcat, produce moartea numai a celulelor care il leaga specific.
Mecanismele genetice ale diversitatii imunoglobulinelor
Sustinuta de dovezi experimentale, teoria selectiei clonale este acceptata. Se pune problema modalitatii de codificare genetica a sintezei unei mari diversitati moleculare de anticorpi. Potentialului imens al unui organism de a sintetiza milioane de tipuri de molecule diferite de anticorpi, ar trebui sa-i corespunda un numar egal de gene codificatoare. Generarea potentialului urias de diversitate genetica s-a explicat in diferite moduri:
-teoria liniei germinate considera ca genele care codifica sinteza domeniilor VL si VH se gasesc in celula germinala. In genomul fiecarui individ s-ar gasi un numar imens de cistroni care s-ar transmite ereditar.
Pentru cele 10^ - irj9 specificitati de legare ale moleculelor de anticorpi, ar exista tot atatea gene codificatoare. Teoria nu explica modalitatile de pastrare in cursul evolutiei, a acestui numar urias de gene si nici posibilitatea sintezei anticorpilor specifici fata de antigenele sintetice;
-teoria recombinarilor somatice presupune existenta unui numar limitat de cistroni codificatori ai domeniilor variabile ale moleculei de anticorp, in linia germinala. Diversificarea specificitatii de combinare a anticorpilor s-ar realiza prin recombinari somatice intre un numar limitat de cistroni, asociate cu diviziunile celulare in cursul diferentierii limfocitelor;
-teoria mutatiilor somatice considera ca repertoriul genelor pentru sinteza imunoglobulinelor este construit de novo in cursul dezvoltarii sistemului imunitar, pornind de la un numar mic de gene ale liniei germinale, prin mutatii la nivelul celulelor somatice. Selectia pozitiva (pastrarea viabilitatii clonelor limfoide cu receptori pentru antigenele exogene) s-ar face sub influenta antigenelor care selectioneaza si stimuleaza proliferarea celulelor mutante, care sintetizeaza anticorpi cu situs de combinare complementar. Teoria presupune persistenta in organism, pentru perioade lungi de timp, a unui numar mare de antigene, ceea ce este improbabil;
-teoriile mixte presupun existenta unui numar limitat de cistroni codificatori ai domeniului variabil (V), in celulele liniei germinale. Diversificarea imensa a potentialului de codificare si sinteza s-ar face prin recombinari somatice intre acesti cistroni, in timpul diviziunilor celulare, declansate de recunoasterea si stimularea antigenica.
Ipoteza lui Dreyer si Bennett (1965) explica diversitatea anticorpilor prin insasi particularitatile lor de structura. Existenta unei singure gene codificatoare pentru regiunile V si C ale moleculei de imunoglobulina este improbabila, deoarece nu este posibil ca o gena sa sufere atatea variatii corespunzatoare capatului NH2 al catenei polipeptidice si sa ramana constanta pentru secventa codificatoare a capatului COOH. Nu se cunoaste nici o situatie in care segmentul ADN corespunzator regiunii constante a unei proteine sa fi ramas nemodificat, iar cel codificator al regiunii variabile sa fie expus fenomenelor mutationale cu o frecventa atat de mare.
Singura modalitate de a explica variabilitatea regiunii N-terminale si constanta regiunii C-terminale este acceptarea ideii ca molecula de imunoglobulina este codificata de mai multe gene distincte - cel putin doua - una pentru regiunea variabila si una pentru regiunea constanta.
in acord cu aceasta ipoteza, in celulele limfoide embrionare ar exista cateva sute de gene codificatoare ale regiunii variabile si o gena pentru regiunea constanta, care s-ar asocia la intamplare in cursul diferentierii limfocitelor B. O molecula functionala de imunoglobulina s-ar sintetiza ori de cate ori recombinarea genetica aduce in limfocitul precursor al plasmocitului, o gena V in apropierea genei C corespunzatoare. Astfel s-ar forma cuplurile de gene functionale VL-CL si VH-CH, codificatoare ale celor doua catene.
Ipoteza venea in contradictie cu cateva dogme ale biologiei celulare si moleculare:
-dogma conform careia, o gena codifica un polipeptid;
-dogma constantei genomului pe toata perioada de dezvoltare a unui organism;
-dogma imposibilitatii rearanjarii genelor intr-o celula somatica;
-dogma continuitatii informatiei genetice. Din aceste motive, ipoteza nu a fost acceptata.
Teoria genelor multiple codificatoare ale unei molecule de imunoglobulina a fost confirmata ulterior prin tehnica cineticii de hibridare (Leder si Swan, 1971). Autorii au aratat ca atat in celulele limfoide embrionare cat si in celulele tumorii de mielom, regiunea constanta a catenelor H si L ale moleculei de imunoglobulina este codificata de o singura gena, iar regiunea variabila este codificata de mai multe gene.
Prin tehnica hibridarii, s-a comparat distributia genelor codificatoare in ADN din doua surse:
-dintr-o tumora de mielom de soarece, ce secreta un lant k;
-din celulele limfoide embrionare (imature) de soarece, ce nu sintetizeaza imunoglobuline.
ADN din ambele surse a fost clivat cu enzime de restrictie, in fragmente separate ulterior prin electroforeza.
Fragmentele codificatoare ale lantului k au fost identificate prin hibridare cu ADNc, obtinut prin transcrierea inversa a ARNm al lantului k. S-au folosit doua tipuri de ARNm ale lantului k:
-un fragment pentru lantul Lkintreg (cu domeniile Vksi Ck);
-un fragment corespunzator jumatatii 3' a ARNm, codificator al domeniului Ck;
Pentru ambele categorii de molecule de ARNm s-au obtinut fragmentele de ADNc corespunzatoare.
in proba cu ADN obtinut din limfocitele embrionare, ADNc al fragmentului Ck a hibridat cu un fragment de ADN ce contine gena Ck, iar ADNc pentru intregul lant k a hibridat atat cu fragmentul genei Ck, cat si cu un alt fragment de ADN rezultat prin clivarea cu enzimele de restrictie, care probabil contine gena Vk.
in concluzie, in celulele limfoide embrionare, cele doua gene codificatoare ale catenei k se gasesc situate la distanta, in fragmente de restrictie diferite.
in proba cu ADN obtinut din celulele limfoide de mielom, ambele probe de ADNc, corespunzatoare domeniului Ck si lantului intreg Vk au hibridat intr-un singur fragment.
in concluzie, in limfocitele mature, cele doua fragmente codificatoare ale lantului k se gasesc in vecinatate imediata, in acelasi fragment de restrictie.
in esenta, genele functionale pentru sinteza imunoglobulinelor in celulele mature sunt rezultatul rearanjarii prin procese de transpozitie, a unor segmente genice mici, mostenite in ADN al liniei germinale.
Rearanjarile au loc in limfocite, pe masura ce ele se diferentiaza din celule imature precursoare, in limfocite B producatoare de anticorpi.
Singurul mecanism care aduce cele doua gene intr-un ansamblu functional este reunirea prin transpozitie si recombinarea genetica a celor doua secvente de ADN pentru a forma o gena activa L si o gena activa H.
Polipeptidele L si H sunt codificate de trei grupuri de gene nelincate:
-grupulgenelor H, pentru sinteza catenelor y, n, a, 8, s (situate pe cromosomul 14 la om si 12 la soarece);
-grupul genelor k, codificatoare ale lantului Lk (situate pe cromosomul 2 si respectiv 6);
-grupul genelor X, pentru sinteza catenei L X (situate pe cromosomul 22 si respectiv 6).
Fiecare din aceste familii cuprinde un numar controversat de gene codificatoare ale regiunii variabile, situate separat, la distanta, de gena codificatoare a regiunii constante a moleculei de imunoglobulina.
Genele pentru catena L a imunoglobulinei de soarece s-au studiat prin donarea fragmentelor de ADN intr-un fag ce se replica in celulele de E. coli.
S-a obtinut astfel o cantitate suficient de mare de ADN al genelor codificatoare pentru catenele Lk si L X, atat din limfocitele embrionare, cat si din celulele limfoide mature de mielom, producatoare de imunoglobuline.
Gena codificatoare a lantului X este formata din 4 segmente separate, ordinea lor in directia 5' — 3' find LX, VX, JX si CX.
Segmentul genic L X codifica 15-20 de aminoacizi ai secventei leader de la extremitatea N-terminala a catenei polipeptidice. Aceasta secventa este clivata pe masura ce lantul strabate membrana reticulului endoplasmic si lipseste din molecula de imunoglobulina matura
Segmentul genic V X codifica cea mai mare parte a regiunii variabile a lantului X, specificand legarea aminoacizilor de la pozitia 1 la 97.
Segmentul genic J X (J, joining = legare) codifica restul regiunii variabile, adica aminoacizii intre pozitiile 98-110.
Segmentul genic C X codifica secventa constanta a catenei L, intre pozitiile 111-214.
Familia de gene codificatoare ale catenei Lk este organizata asemanator cu a genelor L X: secvente leader Lk, asezate in tandem cu cele circa 250 de segmente genice V/c, 5 segmente genice Jk strans legate intre ele (din care unul este defectiv) si la o distanta de 1000 pb se gaseste un singur segment genic Ck.
Genele pentru catena H a imunoglobulinelor au o organizare asemanatoare celei a genelor catenei L. Segmentele genice codificatoare ale catenei H sunt mai numeroase si au o organizare mai complexa, deoarece contin in plus secvente codificatoare D (diversity), intercalate intre secventele VH si JH. Cele circa 12 secvente genice D codifica fiecare 5-15 aminoacizi si amplifica diversitatea biochimica a anticorpilor. Ele confera cea mai mare variatie biochimica a catenei H.
Secventele genice VH par a fi in numar de cateva sute. Fiecare segment VH este asociat cu segmentul LH, codificator al secventei leader. La soarece sunt 200-300 de segmente genice VH, 10-20 segmente D, 4 gene JH si 10 gene CH, iar la om sunt circa 100 segmente genice VH(din care circa jumatate sunt functionaie), circa 30 de gene D si 9 gene J, din care 6 sunt functionaie. Genele VH sunt diseminate in 4 aglomerari.
Genele CH, codificatoare ale regiunii constante ale claselor si subclaselor de catene H, se gasesc in ordinea: n, 8, 73, yi, s §
(nefunctionala), ai, 72,74, s, a2 Fiecare segment genic CH contine mai multi exoni. Fiecare exon codifica un domeniu structural al moleculei de imunogiobuiina.
Asamblarea genei active pentru catena L. Pentru a rezulta o gena functionala Lk, unul din cele circa 250 segmente genice Vk se uneste cu unul din cele 4 segmente genice functionaie Jk, printr-un proces de recombinare probabilistica. impreuna cu gena Ck, se formeaza ansamblul VJC, codificator al catenei Lk, transcris ulterior in ARN premesager. Prin procesul de clivare si inadire, intronii sunt eliminati si rezulta ARNm pentru catena Lk. Se sintetizeaza lantul polipeptidic, iar secventa leader este clivata in cursul transferului prin membrana reticulului endoplasmic. Rearanjarea functionala a genei pentru catena L, stopeaza rearanjarea genelor ce codifica acelasi izotip (fenomenul excluderii alelice).
Asamblarea genei active pentru catena H este similara asambiarii genei active pentru catena L, dar mai complexa, deoarece implica recombinarea a trei regiuni genice distincte ale domeniului variabil: VH, D si JH. Initial s-ar realiza legarea segmentelor genice D si JH, urmata de transpozitia uneia din genele VH in vecinatatea complexului D-JH, pe unul din cromosomii celulei pre-B. Rearanjarile sunt posibile datorita secventelor de recunoastere ale genelor V, D, J.
De cele mai multe ori, rearanjarile genice au loc intracromosomal si foarte rar intercromosomal. Daca rearanjarea este nefunctionala, are loc rearanjarea genelor in celalalt cromosom pereche. In general, rearanjarea are loc la situsul k, iar daca rearanjarea in cei doi cromosomi este neproductiva, este initiata rearanjarea la situsul X.
La complexul VH-D-JH este translocata una din genele CH, care codifica clasa si subclasa catenei H.
Imensa diversitate a specificitatii de legare a anticorpilor este generata prin cateva mecanisme:
1) Diversitatea combinatiilor posibile prin asamblarea intamplatoare a segmentelor genice. De exemplu, cele circa 250 segmente genice Vk si cele 4 segmente functionale Jk produc circa 1000 (250 x 4) combinatii Vk-Jk. Pentru gena H exista posibilitatea unui numar superior de combinatii VH - D - JH: circa 250 segmente VH, 12 segmente D si 4 segmente JH (250 x 12 x 4 = 12000).
2) Flexibilitatea jonctionala a segmentelor genice. in momentul asamblarii complexelor VH - D - JH sau VL - JL se produc deletii, aditii, substitutii de baze, care modifica circa 3 aminoacizi la fiecare jonctiune. Numarul variantelor biochimice ale moleculelor de imunoglobulina creste de 3 ori pentru lantul L (1000 x 3) si de 9 ori pentru catena H (12 000 x 9 = 100000).
Aditiile si deletiile care insotesc legarea segmentelor genice VL-JL trebuie sa se faca astfel incat sa se pastreze unicul cadru de citire al tripletelor pentru fiecare segment genic V si J. Daca legarea segmentelor genice introduce sau pierde 1 sau 2 nucleotide (sau alt numar nedivizibil cu 3), secventa in aval nu va fi citita. Aceasta este o rearanjare genica neproductiva.
Segmentele genice D pot fi citite in toate cele 3 cadre de citire, in diferite recombinari V-D-J, ceea ce contribuie semnificativ la diversitatea anticorpilor.
3) Diversitatea combinatoriala prin imperecherea intamplatoare a catenelor H si L. Daca oricare lant L poate fi imperecheat cu oricare lant
H, vor rezulta peste 10^ variante de imunoglobuline (100000 H x 3000 L).
4) Aditii de nucleotide in regiunea N. Cea mai variabila regiune a moleculei de anticorp este cea de a lll-a secventa determinanta de complementaritate a catenei H (aminoacizii 86-91), locul de unire a segmentelor genice VH-D si D-JH. Aici se gasesc scurte secvente de aminoacizi, foarte variabile, denumite regiuni N. Ele sunt codificate de secvente de nucleotide adaugate de enzima terminal-deoxinucleotidil-transferaza (TdT), activa in celulele limfoide imature, capabila sa adauge nucleotide la capatul 3' al catenei de ADN in curs de sinteza, fara sa necesite matrita. Activitatea TdT este minima la fat si la noul-nascut, dar este stimulata postnatal. Enzima actioneaza preponderent pe genele catenei H, dar regiunile N s-au identificat si la jonctiunile V-J ale catenei L.
5) Mutatiile somatice. Un numar de ordinul milioanelor de variante ale regiunii V pot sa apara prin substitutii unice de nucleotide in segmentul genic V. Acesta este fenomenul hipermutatiei somatice a domeniilor variabile, care este activat mai ales in conditiile imunizarii intense, ceea ce explica cresterea afinitatii anticorpilor pentru epitopul stimulator.
Hipermutatia somatica este mecanismul esential pentru generarea diversitatii anticorpilor. La om, hipermutatia somatica se produce in prezenta antigenului si are loc in centrii germinativi din tesutul limfoid periferic.
Rearanjarile genice se produc, initial, la nivelul genei pentru sinteza catenei H. Catena H apare prima in citoplasma limfocitelor. Ulterior are loc rearanjarea genelor ce codifica sinteza catenei L.
Rearanjarea genelor se desfasoara continuu in limfocitele B din maduva osoasa hematogena. Limfocitele care nu genereaza o rearanjare genica productiva sunt eliminate, nefiind utile sistemului imunitar. Probabil ca pentru o rearanjare productiva sunt necesare, statistic, multe altele neproductive, ceea ce presupune ca pentru fiecare limfocit functional se pierde un numar mare de celule. Teleonomic insa, risipa este justificata de importanta esentiala a functiei imunitare pentru organism.
Mecanismele de recombinare genica permit ca in contextul existentei a mai putin de 1000 de gene in linia germinala, organismul sa produca o mare diversitate de anticorpi (cateva miliarde), ceea ce constituie repertoriul imunoglobulinelor.
Descoperirea mecanismelor genetice de transpozitie, generatoare a uriasei diversitati a specificitatii de combinare a anticorpilor, a deschis o noua cale a intelegerii asupra modului in care informatia genetica poate sa fie diversificata.
Mecanismele de transpozitie sunt active in limfocitele B, dar si in celulele liniei T, in care codifica o diversitate asemanatoare a receptorului de antigen al acestor celule, dar nu au fost identificate pentru alte gene.
Mecanismele genetice ale generarii diversitatii RCTi
Mecanismele genetice generatoare ale diversitatii specificitatii de legare a RCTi sunt asemanatoare cu cele care genereaza diversitatea imunoglobulinelor. Calculele teoretice sugereaza ca exista posibilitatea a cel putin 1014 combinatii TCR 2.
Genele codificatoare pentru Ti s-au studiat dupa donarea ADNc, obtinut prin metoda hibridarii substractive* . S-a studiat distributia genelor atat in celulele T embrionare, cat si in limfocitele T mature. Se cunosc mai bine genele care codifica lantul p. Ele sunt plasate in 4 regiuni distincte, care corespund segmentelor V, D, J, C. Nu se cunoaste numarul genelor in fiecare regiune.
Prima treapta este sinteza ADNc din ARNm al limfocitelor T. ADNc este hibridat cu ARNm in mare exces, din limfocitele B. Secventele de ADNc care nu hibrideaza cu ARNm, probabil vor reprezenta secventele de ARNm specifice numai limfocitelorT.
Regiunea C are doua segmente genice distincte: C p 1 si C p 2. Regiunea J are doua grupuri de minigene: J p 1 si J p 2, fiecare cu cate 7 segmente genice (unul este nefunctional). Regiunea D are un numar nedefinit de gene (D1 - Dy), iar regiunea V are circa 30 de gene.
Formarea unei gene functionale implica rearanjarea celor 4 segmente genice, dar rearanjarile sunt mai versatile decat ale genelor codificare pentru moleculele de imunoglobuline si rezulta mai multe variante: Vb - Jb ; Db - Db; Db - Jb; Vb - Db - Jb. Tipul dominant de recombinare pare a fi V - D - J - C.
Diversitatea RCT se realizeaza prin mai multe mecanisme:
-numarul mare de gene V, D, J;
-asocierile combinatoriale diverse ale segmentelor V - D- J. Ele sunt mai diversificate decat ale genelor pentru imunoglobuline, fiind posibile rearanjari D - D si V - J;
-diversitatea jonctionala prin deletie sau aditie de baze, la legarea segmentelor V, D, J.
Rearanjarile genice pentru RCTi se produc in timocitele imature, in zona corticala a timusului, inainte de a ajunge in zona medulara.
Rearanjarea genelor V p pe unul din cromosomi, supreseaza rearanjarea genelor pe cromosomul pereche (excludere alelica), astfel ca fiecare celula exprima un singur tip de catena RCT p. Rearanjarea genelor alele a nu este supusa fenomenului excluderii alelice si de aceea fiecare celula are doua tipuri de receptori de antigen (RCT), fiecare avand propriul sau lant a, dar lantul p este comun. Surprinzator, celulele CDs din epiteliul intestinal, care sunt generate extratimic, au RCT format din homodimeri a - a.
DEZVOLTAREA ONTOGENETICA A SISTEMULUI IMUNOCITAR
Limfocitele T si B se diferentiaza dintr-o celula stem (celula mama, tulpina, de origine), care nu a fost identificata, fiind doar ipotetica, deoarece nu are caractere structurale distinctive.
Celula stem este de origine mezenhimala. La pasari si mamifere, celula stem apare in mezenhimul paraaortic al embrionului, avand un potential foarte inalt de multiplicare si diferentiere.
Celula stem este pluripotenta, chiar totipotenta, deoarece prin multiplicare si diferentiere, genereaza toate categoriile de celule sanguine: granulocite, monocite, limfocite, mastocite, megacariocite, eritrocite. Diferentierea initiala a celulei stem este pe linie eritrocitara si mieloida, iar diferentierea pe linie limfoida este ulterioara si simultana cu procesul de maturare.
Maturarea limfocitelor semnifica dobandirea imunocompetentei, adica a capacitatii de a recunoaste specific antigenul si de a se activa.
Din mezenhimul paraaortic, celula stem migreaza in sacul vitelin, unde, pentru un interval de timp se desfasoara hematopoeza.
Sacul vitelin este sediul esential al diferentierii celulelor stem pe cale limfoida, la pasari si mamifere, inainte de migrarea lor in ficat si splina. Dupa cultivarea embrionului total de soarece, fara sacul vitelin, inainte de migrarea si colonizarea sa cu celule stem limfoide, nu s-a evidentiat diferentiere celulara pe cale limfoida. Ulterior in viata embrionara, functia hematopoetica este preluata de ficat si splina. In aceste organe, celulele stem se divid cu o rata inalta si se diferentiaza pe linie eritrocitara, mieloida (granulocitara), monocitara, limfoida.
in ultima parte a vietii embrionare, functia hematopoetica este preluata de maduva osoasa, chiar daca ficatul si splina pastreaza o activitate hematopoetica foarte limitata si un scurt interval dupa nastere.
Celulele limfoide diferentiate in maduva osoasa, la pasari, migreaza initial in splina si ficat, iar de aici migreaza in organele Iimfoide centrale (timus si bursa lui Fabricius).
La mamifere, din maduva osoasa, limfocitele migreaza in ficat si splina. Unele isi dobandesc competenta imunitara chiar in maduva osoasa, in ficat sau in splina, organe care indeplinesc functiile bursei la pasari, iar altele migreaza in timus. Acesta este circuitul primar al limfocitelor, in care se produce diferentierea independenta de antigen, in cursul careia limfocitele devin imunocompetente. Aceasta etapa se desfasoara in organele Iimfoide primare (timus, bursa lui Fabricius si echivalentii bursali ai mamiferelor). In cursul ei, limfocitele dobandesc receptori specifici de antigen.
A ll-a faza a diferentierii limfocitelor este dependenta de antigen si se produce in circuitul secundar. Limfocitele imunocompetente trec in circuitul sanguin si de aici migreaza in tesuturile Iimfoide secundare, de unde, pe cale limfatica se reintorc in sange. In circuitul secundar, limfocitele au sansa intalnirii cu antigenul specific receptorului lor, se activeaza, prolifereaza si se diferentiaza spre stadiile de celule efectoare si celule cu memorie.
Mecanismele moleculare care conditioneaza migrarea limfocitelor din splina si ficat, in organele limfoide primare, nu se cunosc. Este un proces aleatoriu sau este programat de receptori celulari, eventual dobanditi in aceste organe. Daca este un proces conditionat, inseamna ca in ficat, celulele limfoide sunt deja pre-B (prebursocite) si vor migra in bursa lui Fabricius si respectiv pre-T (pretimocite), care vor migra in timus.
Rolul bursei lui Fabricius in diferentierea limfocitelor B
Bursa lui Fabricius este un organ limfoepitelial si se dezvolta ca un diverticul dorsal al intestinului terminal, situat langa cloaca. Primordiul bursal se observa la embrionul de 4 zile de incubatie, ca un mugure epitelial in regiunea cloacala. Pe masura ce creste, mugurele se vacuolizeaza si vacuolele prin coalescenta, formeaza lumenul bursal. Pe suprafata interna a cavitatii bursale, epiteliul formeaza pliuri longitudinale, prolifereaza si constituie aglomerari celulare (muguri epiteliali) in lamina propria. Formarea mugurilor epiteliali este dependenta de interactiunea celulelor epiteliale cu tesutul mezenhimal. Celulele stern limfoide din sacul vitelin colonizeaza mugurele epitelial in zilele 8-11 de dezvoltare embrionara. Fiecare mugure epitelial este colonizat de 1-3 celule stern limfoide prebursale. Celulele limfoide prolifereaza intens si formeaza medula foliculilor bursali.
Atat celulele epiteliale ale bursei cat si celulele stern ale liniei limfoide prolifereaza intens in cursul vietii embrionare, dar si 2-4 saptamani dupa ecloziune. La 4 saptamani dupa ecloziune, bursa contine circa 10 000 de foliculi, fiecare avand circa 10 5 limfocite.
Celulele stern limfoide prebursale sunt originare in mezenhimul embrionar. inainte de a ajunge in bursa, genele pentru sinteza imunoglobulinelor s-au rearanjat, fiind angajate in dezvoltarea pe linia B. La 12 zile de incubare, in interiorul bursei apar celule care exprima IgM membranar, iar la ecloziune, circa 90% din celulele bursale au IgM pe suprafata lor si sub 1% exprima IgG sau IgA.
Celulele epiteliale din zona medulara formeaza o retea laxa, avand o structura interna de tip secretor. In zona medulara, pe langa celulele epiteliale se gasesc limfocite, plasmocite, fagocite. Regiunea medulara si cea corticala sunt separate prin membrana bazala. La suprafata lumenului bursal, celulele epiteliale se diferentiaza in epiteliul asociat foliculului, cu functia de a fagocita si de a transporta materialul antigenic, din lumenul bursal, in regiunea medulara. Celulele epiteliale din epiteliul asociat foliculilor si cele din medula bursala sunt diferite in privinta capacitatii de a fagocita si a activitatii enzimatice.
La ecloziune, bursa are 30-40 mg, atinge dezvoltarea maxima (3-4 g) la 2-4 luni si se mentine pana la 4-6 luni, cand incepe sa involueze si se atrofiaza la maturitatea sexuala, cand dispar complet structurile limfoide si epiteliale.
Bursectomia la ecloziune nu impiedica migrarea limfocitelor B la periferie, pentru ca procesul incepe timpuriu in dezvoltarea embrionara, indepartarea chirurgicala a primordiului sau ablatia chimica a epiteliului bursal prin tratament cu testosteron, se poate face la 2-5 zile de incubare, inainte ca foliculii bursali sa fie populati de celulele stem limfoide. La pasarea adulta timectomizata, numarul de limfocite B in organele limfoide periferice nu este influentat. Se gasesc plasmocite si anticorpi, dar cu un repertoriu foarte limitat al specificitatii de legare, ceea ce denota o maturare extrabursala foarte limitata a limfocitelor B. Concluzia este ca bursa lui Fabricius nu este strict necesara pentru asamblarea genelor codificatoare ale sintezei imunoglobulinelor si nici pentru diferentierea limfocitelor B, dar are un rol esential pentru diversificarea clonala a limfocitelor B, adica pentru diversificarea repertoriului lor antigenic.
Bursa lui Fabricius este un organ limfoid specializat in care se produce diversificarea somatica extensiva a genelor rearanjate pentru sinteza anticorpilor, cat si expansiunea clonala a limfocitelor.
Spre deosebire de mamifere, la care generarea diversitatii celor circa 10^ specificitati de legare a anticorpilor se face prin legarea combinatoriala a segmentelor genice V-D-J (pentru catena H) si a segmentelor genice V-J (pentru catena L), linia aviana de evolutie a vertebratelor a exploatat o alta strategie pentru generarea diversitatii specificitatii de legare a moleculelor de anticorpi. In timpul dezvoltarii embrionare a puiului de gaina, potentialul generarii diversitatii genetice prin procese de recombinare genica este limitat, deoarece regiunea variabila a catenei H si a catenei L este codificata de secvente genice functionale unice V si J. Conversia genica are loc cu o rata mare intre singura gena functionala V (VH-| sau VL-|) si un grup de pseudogene V. De aceea, rearanjarea genelor in celulele embrionare ale liniei limfoide, inainte de migrarea in bursa, va produce o diversitate foarte limitata a specificitatii de legare a anticorpilor. Micromediul bursal selecteaza si favorizeaza diferentierea celulelor stem bursale care sufera o conversie genica productiva, iar celelalte (circa 90%), probabil cu conversie neproductiva, mor prin apoptoza in interiorul bursei.
intre celulele epiteliale ale bursei si celulele liniei limfoide se stabilesc interactiuni foarte stranse, esentiale pentru diversificarea specificitatii antigenice a limfocitelor B. Efectul bursei este mediat de factori humorali, ca de exemplu, bursopoetina, un polipeptid mic, capabil sa induca diferentierea limfocitelor B in vitro.
Diferentierea limfocitelor B la mamifere
Diferentierea liniei celulare B este ulterioara diferentierii liniilor eritrocitara si mieloida.
La mamifere, primul