Moleculele de anticorpi ale unui ser imun sunt foarte heterogene din punctul de vedere al specificitatii lor de combinare cu epitopii antigenici inductori, deoarece, atat antigenele moleculare, dar in special cele corpusculare (virusuri, celule), prezinta o mare diversitate de epitopi. Chiar si antigenele moleculare cele mai simple sunt mozaicuri de epitopi. Specificitatea de combinare a moleculelor de anticorpi corespunde epitopilor fata de care s-au sintetizat. i6d5dn
Diversitatea uriasa a specificitatii de combinare a anticorpilor
(evaluata la 108-109) genereaza o heterogenitate biochimica de acelasi nivel, materializata in variatia secventei de aminoacizi, ceea ce a constituit un obstacol major in calea studiului lor prin metode analitice, desi anticorpii se gasesc totdeauna in sange, cu exceptia cazurilor patologice de agamaglobulinemie.
Analiza biochimica a imunoglobulinelor a fost conditionata de existenta unei surse omogene de molecule de anticorpi, cu o secventa identica a aminoacizilor. Conditia identitatii secventei de aminoacizi este indeplinita de anticorpii care au aceiasi specificitate de legare, nu fata de un antigen, ci fata de un singur epitop.
Proteinele de mielom
Sursa naturala de molecule de imunoglobulina, omogene, identice din punct de vedere biochimic (monoclonale), este mielomul multiplu (plasmocitomul), o afectiune tumorala maligna, initiata in maduva osoasa si rezultata prin proliferarea unui plasmablast.
Plasmocitomul produce molecule de imunoglobuline identice din punct de vedere biochimic si al sarcinii electrice, denumite proteine de mielom, deoarece toate celulele tumorii sunt descendente ale unei singure celule producatoare de anticorpi. Moleculele secretate de o tumora de mielom se numesc proteine M (Melom) sau paraproteine si pot sa reprezinte pana la 95% din totalul gamaglobulinelor plasmatice.
Tumorile de mielom apar spontan cu o frecventa mica la om, caine, cal, sobolan, soarece sau se induc experimental la soarecii liniilor inbred NZB si BALB/c. Tumora este transplantabila in serie.
Uneori, proteinele M au aceiasi secventa de aminoacizi ca si imunoglobulinele normale, dar adeseori, sinteza catenelor patologice este incompleta: lipsesc diferite secvente de aminoacizi, de diferite lungimi.
Rareori, proteinele de mielom isi pastreaza chiar proprietatea de a lega specific determinanti antigenici cunoscuti: de exemplu, 5% din proteinele M ale unei linii inbred de soarece, leaga determinanti antigenici ai suprafetei celulelor bacteriene enterice, ceea ce sugereaza ca tumora isi are originea in descendentii limfocitelor B, care prolifereaza ca raspuns la stimularea specifica cu antigene ale microbiotei enterice.
Tumorile de mielom, de cele mai multe ori, secreta molecule incomplete sau fragmente de molecule imunoglobulinice.
In celulele tumorilor de mielom, rata sintezei catenelor H si L este dezechilibrata. De exemplu, mielomul Bence-Jones, sintetizeaza catenele L in mare exces. Proteinele Bence-Jones sunt dimeri de lanturi L (k sau X). Una din cele doua catene L are rolul catenei H si participa la formarea situsului de legare. Molecula patologica are activitate de anticorp fata de unele componente tisulare sau fata de antigene mici.
Mielomul lanturilor grele sintetizeaza numai catenele H ale izotipurilor a, y sau |a, iar mielomul macroglobulinemiei Waldenstrom sintetizeaza molecule de IgM. Majoritatea mieloamelor produc proteine Bence-Jones.
in laboratorul clinic, diagnosticul de mielom se pune dupa detectarea in ser, prin electroforeza, a unei cantitati mari de molecule ale unui izotip de imunoglobulina (circa 50 mg/ml).
Proteinele de mielom precipita la 50-60°, la pH 4-6, se redizolva prin incalzire la 80-90° si reprecipita prin racire.
La pacientii cu mielom, in special la cei cu macroglobulinemie Waldenstrom, vascozitatea sangelui creste mult, datorita cantitatii excesive de proteine produse de mielom. Eliminarea proteinelor patologice se face prin procedeul plasmaferezei. Plasmafereza este tehnica de recoltare a unor volume mari de sange, urmata de reintroducerea in organism, a celulelor sanguine suspendate intr-un inlocuitor de plasma.
Surse artificiale de anticorpi monoclonali. Tehnologia hibridomului
Metoda clasica de obtinere a anticorpilor necesari studiilor clinice si de diagnostic, consta in stimularea repetata, prin injectarea antigenului intr-un organism cu reactivitate imunitara optima. Cand titrul anticorpilor specifici este maxim, animalul este sangerat si se obtine serul imun (antiserul), care este folosit in stare nativa sau este utilizat pentru purificarea anticorpilor. Metoda are cateva dezavantaje:
-cantitatea si calitatea anticorpilor fata de un antigen variaza de la un organism la altul si chiar intre sangerarile succesive ale aceluiasi animal;
-serul imun este un amestec foarte heterogen de molecule de anticorpi, chiar si in cazul in care imunizarea se face cu un antigen cu grad inalt de puritate;
-oricat de simplu ca structura moleculara, un antigen are mai multi epitopi care stimuleaza mai multe clone de limfocite, ce produc anticorpi cu specificitati si afinitati diferite;
-antigenele inalt purificate contin impuritati antigenice care induc sinteza anticorpilor specifici in cantitati disproportionat de mari;
-chiar dupa purificare - proces costisitor - antiserurile contin anticorpi cu afinitati diferite si cu reactivitate incrucisata.
Din aceste cauze, toate serurile imune sunt amestecuri de anticorpi policlonali, in cantitati variabile de la un organism la altul. Obtinerea unor cantitati mari de anticorpi cu specificitate de legare fata de un epitop unic, prin metoda clasica este imposibila.
Tehnologia moderna de obtinere a anticorpilor omogeni, denumita hibridoma (hibrid + mieloma) a fost propusa de Kohler si Milstein (1975), se bazeaza pe urmatoarele principii metodologice si teoretice:
1) Antigenul purificat se injecteaza animalelor de experienta.
2) La momentul adecvat, din splina sau din ganglionii limfatici, se separa limfocitele. Fiecare limfocit si plasmocitele derivate sintetizeaza molecule omogene de anticorpi, cu specificitate unica de combinare pentru un singur epitop, denumiti anticorpi monoclonali (AMC).
3) Limfocitele B traiesc putin in afara organismului, iar plasmocitele care sintetizeaza cea mai mare cantitate de anticorpi, nu supravietuiesc in vitro si de aceea cultivarea sau donarea lor nu este posibila.
4) Celulele de mielom sunt nemuritoare, datorita capacitatii lor de a se mentine un timp nelimitat in cultura. Fuziunea lor cu limfocitele B in vitro, le confera celor din urma proprietatea de "nemurire", rezultand o celula hibrida(hibridom), care sintetizeaza si secreta anticorpi monoclonali (AMC). AMC sunt considerati ca varianta in vitro a proteinelor de mielom, pentru ca in ambele cazuri, o dona de limfocite prolifereaza si secreta anticorpi cu o anumita specificitate
5) Hibridomul producator de anticorpi mosteneste caracteristici atat de la limfocit - adica secreta anticorpi cu specificitate fata de un antigen, cat si de la celula de mielom, adica este nemuritor.
6) Celulele hibridoma pot fi donate individual si fiecare dona produce anticorpi specifici fata de un singur determinant antigenic. Ele pot fi mentinute indefinit prin pasaje in vivo sau prin cultivare in vitro.

Etapele obtinerii hibridomului
Metodologia obtinerii unei linii celulare hibride, nemuritoare, producatoare de AMC, parcurge mai multe etape.
1. Obtinerea celulelor de mielom. Baza tehnologiei hibridomului a fost obtinerea unei linii celulare mutante de mielom, care nu secreta anticorpi si este deficienta pentru
/7ipoxantin-guanozin-/bsfo-/ibozil-?ransferaza (HGPRT).
Mielomul (plasmocitomul) este rezultatul diviziunilor necontrolate ale unui singur plasmablast sau ale unui precursor al sau din linia limfocitara B. Proliferarea necontrolata este insotita de sinteza unor cantitati mari de molecule omogene de imunoglobulina, cu proprietati biochimice uniforme. Moleculele sintetizate de tumorile de mielom se deosebesc de imunoglobulinele normale, prin aceea ca nu prezinta specificitate de legare cu antigenul.
Tumorile de mielom apar spontan la multe mamifere, iar la om, 1% din tumori sunt mieloame. Tumorile de mielom se induc experimental la mai multe linii de soarece (BALB/c si NZB), dupa injectarea intraperitoneala a uleiurilor minerale, sau dupa implantarea materialelor plastice, care produc o reactie inflamatorie cronica. Tumorile apar dupa 120-130 de zile si se pot mentine prin pasaje seriate la soareci din aceiasi linie inbred sau prin cultivare in vitro si produc cantitati suficiente de imunoglobuline pentru analiza biochimica. Nu s-au obtinut mieloame care sa sintetizeze anticorpi cu specificitate de legare fatade un antigen.
Hibridoamele se obtin din linii speciale de mielom, care au doua particularitati mutationale:
-nu sintetizeaza propria molecula de imunoglobulina, astfel ca celula hibrida va produce exclusiv molecule de imunoglobulina caracteristice limfocitului B normal;
-sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, necesara sintezei acizilor nucleici.
-Pentru hibridare sunt disponibile linii celulare de mielom de soarece, de sobolan, de om, dar cea mai folosita este linia P3-X63-Ags, izolata de la linia BALB/c, cu urmatoarele caracteristici:
-este HGPRT";
-este tumorigena pentru soarece;
-are o frecventa relativ inalta (1/10 5-106) de fuziune cu limfocitele de soarece;
-nu sintetizeaza imunoglobulina proprie si nu represeaza genele pentru sinteza imunoglobulinei in hibridom;
-are o eficienta inalta de donare in vitro.
Deoarece sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, celulele sale nu detoxifica efectul aminopterinei, care se adauga in mediul de crestere. Aminopterina, un antagonist al reductazei acidului folie, blocheaza calea sintezei ADN prin inhibitia sintezei purinelor (A, G) si a timidinei. in mediul cu aminopterina, celulele cu HGPRT" nu supravietuiesc.
2. Imunizarea. Obtinerea unei populatii mari de limfocite B, prin fenomenul expansiunii clonale, angajate in sinteza anticorpilor specifici fata de un anumit epitop, se realizeaza prin imunizare. Antigenul stimuleaza mai multe clone de limfocite. Fiecare dona de limfocite activate, sintetizeaza anticorpi specifici fata de unul din epitopii antigenului. Procedura de imunizare (cantitatea de antigen, tipul de adjuvant, calea de administrare) este selectata empiric.
Cea mai buna sursa de limfocite ramane splina de soarece si de sobolan, dar in special soarecele BALB/c, pentru ca mielomul are aceiasi origine si prin hibridare se evita incompatibilitatea CMH. Hibridoamele de sobolan, obtinute prin fuziunea limfocitelor splenice cu celule de mielom, sunt mai stabile si anticorpii pe care ii sintetizeaza fixeaza complementul.
Cantitatea de antigen necesara pentru imunizare depinde de imunogenitatea acestuia. Antigenele celulare bacteriene sau ale celulei eucariote sunt foarte imunogene. Antigenele solubile (polipeptide, glucide, hormoni) sunt slab antigenice. Imunogenitatea lor creste dupa cuplarea cu hemocianina de Limulus (KLH) sau cu albumina. Cea mai buna imunizare se obtine prin injectare intravenoasa sau intraperitoneala repetata, timp de cateva saptamani sau luni, a antigenului slab imunogen.
Splina se recolteaza inainte de atingerea titrului maxim al anticorpilor serici. Blastele fuzioneaza mai usor decat celulele in repaus. O alternativa a imunizarii este stimularea limfocitelor in vitro, prin incubarea in prezenta antigenului.

3. Fuziunea se realizeaza in scopul "imortalizarii" celulelor producatoare de anticorpi si este esenta biotehnologiei hibridomului. Scopul "imortalizarii"este pastrarea capacitatii limfocitelor individuale de a secreta un singur tip de AMC, prin cresterea nelimitata in timp, fara senescenta, in vivo sau in vitro, ca o consecinta a transformarii, indusa cu celule de mielom.
Limfocitele sau imortalizat pe trei cai:
-prin fuziune cu celule tumorale de mielom
-prin infectie cu un virus transformam ADN
-prin transfectie cu ADN transformam din celulele maligne sau cu ADN al unui oncodnavirus.
Cea mai utilizata metoda de "imortalizare" este aceea a fuziunii cu o celula de mielom. Fuziunea limfocitelor viabile din splina, obtinute prin dezagregare mecanica, cu celulele de mielom HGPRT" se realizeaza prin amestecul lor in proportie de 2-5 celule splenice/o celula de mielom. Procesul fuziunii este stimulat pe mai multe cai, dar cel mai adesea se foloseste PEG cu gr. mol. de 4000 D. Amestecul de celule se mentine 3 minute in 0,20-0,50 ml PEG 40%, la 37°, pH 7,5-8,0. Frecventa fuziunii creste sub actiunea impulsurilor electrice scurte, de mare intensitate.
Numarul si varietatea hibridoamelor obtinute este mare, ceea ce impune selectia celor producatoare de anticorpi cu specificitatea dorita.
4. Selectia celulelor de hibridom. Amestecul de fuziune contine celule splenice si celule de mielom nefuzionate, celule splenice fuzionate intre ele, celule de mielom fuzionate intre ele si celule hibridom, rezultate prin fuziunea splenocitelor cu celule de mielom.
Selectia are ca scop, separarea celulelor de hibridom si eliminarea din amestec, a celorlalte tipuri celulare, nefuzionate sau fuzionate neutilizabile. In acest scop, amestecul de celule se cultiva pe mediul selectiv HAT (ftipoxantina-aminopterina-/imidina), in care splenocitele nefuzionate si fuzionatii splenocit x splenocit mor in 1-2 saptamani, coplesite fiind numeric de celulele de hibridom, care se divid la fiecare 17-24 de ore.
Mediul selectiv HAT permite supravietuirea numai a fuzionatilor mieiom x splenocit si este inhibitor pentru celulele de mieiom, ca si pentru fuzionatii mieiom x mieiom. Actiunea sa selectiva se bazeaza pe urmatoarele conditii experimentale: a) Aminopterina din mediul HAT biocheaza sinteza purineior (A, G) pe calea inozin-monofosfatului si astfel biocheaza sinteza acizilor nucleici. In acest mediu, celulele HGPRT" devin dependente de surse externe de purine
(A, G) si de timidina. Hipoxantina din mediul HAT poate fi convertita la inozin-monofosfat, de catre enzima HGPRT si se formeaza adenozin-monofosfat si guanozin-monofosfat. Timidina poate fi fosforilata la timidin-monofosfat si timidin-trifosfat, de catre enzima TK. Ambele enzime (HGPRT si TK) se gasesc in splenocitele normale. b) Celulele de mieiom sunt HGPRT" si pe mediul selectiv HAT nu supravietuiesc nici celulele ca atare, nici fuzionatii mielom-mielom. Pe acest mediu supravietuiesc si se divid indefinit, celulele de hibridom, deoarece sunt HGPRT+ (codificata de genomui spienociteior) si sunt "nemuritoare", calitate conferita de celulele de mieiom.
5. Clonarea. Clona este o populatie de celule identice, genetic stabile, derivate din diviziunea unei singure celule. Clonarea se face prin diseminarea suspensiei celulare diluate, pe medii nutritive agarizate. Fiecare celula de hibridom, prin diviziuni succesive, produce o colonie, adica o clona celulara. Operatia de donare se repeta pentru a garanta o descendenta omogena.
Dintre sutele de hibridoame donate, este necesara selectarea celor cu capacitate de sinteza a anticorpilor specifici fata de antigenul cu care s-a facut imunizarea.
Hibridoamele producatoare de anticorpi cu specificitatea dorita, se cultiva in vitro, in culturi cu perfuzie continua cu mediu proaspat sau in bioreactoare cu capacitate mare.
Cea mai simpla tehnica este a cultivarii in vivo si consta in inocularea intraperitoneala a circa 2 x 106 celule hibridoma, la organisme ale aceleasi linii genetice (pentru evitarea fenomenului de incompatibilitate CMH). Hibridomul se dezvolta intraabdominal si lichidul de ascita care o insoteste, contine anticorpi in proportie de 50% din totalul proteinelor sale.
Randamentul producerii AMC in vivo este de 100-1000 de ori mai mare decat in vitro. Anticorpii din lichidul ascitic se purifica prin fractionare cu sulfat de amoniu sau prin metoda cromatografiei cu schimb de ioni.
Avantajele biotehnologiei hibridomului
Producerea AMC prin tehnologia hibridomului are un avantaj net fata de metoda conventionala a obtinerii serului imun, deoarece se pot obtine anticorpi specifici produsi de cate un hibridom, pentru fiecare epitop al unui antigen natural. Clonarea individuala a fiecarui hibridom, creeaza conditii ca fiecare dona celulara sa secrete anticorpi cu specificitate unica fata de un singur epitop al unui antigen.
Celulele de hibridom prolifereaza rapid, ceea ce scurteaza timpul necesar obtinerii AMC.
Hibridoamele produc cantitati foarte mari de anticorpi, ce depasesc de cateva ori concentratia anticorpilor din serul animalelor imunizate.
Clonele de hibridom se mentin indefinit prin cultivare in vitro sau in vivo.
Hibridomul ofera posibilitatea obtinerii AMC marcati, prin adaugarea precursorilor marcati radioactiv (marcare interna). Anticorpii marcati in situ (in timpul sintezei) ofera un avantaj net in raport cu anticorpii marcati dupa purificare (marcare externa). Marcarea externa cu I125 implica purificarea imunoglobulinelor din antiserul conventional, dar presupune modificarea chimica si denaturarea partiala, cu pierderea proportionala a specificitatii de legare.
Pentru marcarea interna se folosesc elemente radioactive cu perioada de injumatatire mai lunga decat a I125 : C14, S35, H3. Marcajul radioactiv intern este net superior celui cu peroxidaza si feritina, utilizat in tehnicile conventionale.
Tehnologia hibridomuiui este un model experimental care poate fi extins si la alte categorii de celule care sintetizeaza substante utile (interferon, insulina). Obtinerea unor hibrizi dintre celula de mielom de soarece si un limfocit normal, de la aceiasi specie, in scopul producerii AMC, a introdus un concept nou in biologia moleculara - conceptul imortalizarii functiilor specifice diferentiate.
Aplicatii practice ale AMC
AMC reprezinta un reactiv imunochimic bine definit si de aceea, rezultatele obtinute prin utilizarea lor sunt reproductibile.
AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate in cercetare, in diagnosticul clinic, in farmacologie pentru profilaxia si terapia unor infectii la om si animale, in tehnicile de biochimie analitica pentru purificarea unor molecule.
in domeniul cercetarii imunocitochimice*, AMC sunt reactivi cu inalta specificitate, utilizati pentru identificarea unor proteine care se gasesc in cantitati foarte mici. De exemplu, AMC marcati cu fluoresceina permit evidentierea moleculelor membranare, inaccesibile investigatiei cu metodele clasice. AMC au fost markeri eficienti pentru identificarea diferitelor subpopulatii de limfocite T si B, a antigenelor membranare ale celulelor seriei mieloide si monocitare. Sistemul CD (duster differentiation) este definit in intregime pe baza utilizarii AMC si cuprinde acum peste 200 de markeri de suprafata. AMC cu specificitate CD se folosesc pentru a detecta aparitia sau absenta populatiilor celulare in timpul stimularii antigenice.
Datorita specificitatii lor de legare, AMC se folosesc pentru a evidentia diferentele antigenice minore intre diferite variante moleculare. Astfel sau identificat variatiile compozitiei in aminoacizi ale spiculelor glicoproteice, consecutive driftului antigenic la virusul influenza A.
AMC se folosesc pentru identificarea moleculelor neurotransmitatoare, a receptorilor sinaptici si a enzimelor de biosinteza. S-au obtinut AMC fata de receptorul de acetilcolina, dar dificultatile sunt mari pentru ca neurotransmitatorii sunt antigene slabe.
in diagnosticul serologic, serurile imune obtinute prin metoda clasica au avut adeseori inconvenientul major al lipsei reproductibilitatii rezultatelor. AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate pentru diagnosticul rabiei pe sectiunile de tesut nervos al animalelor infectate,
Anticorpul este marcat cu o molecula generatoare de semnal (de exemplu, un fluorocrom, o enzima producatoare de culoare prin actiunea sa asupra substratului specific, ori o particula metalica). Sensibilitatea metodei, adica puterea semnalului poate fi marita prin cresterea raportului dintre molecula indicator (anticorpul marcat) si antigen. Imunocitochimia necesita producerea anticorpilor specifici si tratamentul adecvat al tesuturilor, adica fixarea si histoprepararea pentru a favoriza interactiunea optima intre reactiv si molecula tinta a hepatitelor virale B, C, D, a infectiei cu HIV (prin determinarea prezentei antigenelor in ser) si a unor infectii bacteriene. Pentru diagnostic se folosesc anticorpi marcati cu fluoresceina sau metodele ELISA sau RIA.
AMC se folosesc pentru diagnosticul neoplaziilor, pe baza evidentierii antigenelor specific-tumorale. In acest scop se utilizeaza AMC marcati cu izotopi radioactivi, cu specificitate fata de CEA, AFP etc.
AMC se folosesc pentru detectarea hormonilor polipeptidici: TSH, FSH, HCG. Hormonii sunt molecule cu un numar mic de epitopi. Subunitatile a ale diferitilor hormoni sunt foarte asemanatoare, dar difera in special prin catenele p. Exista AMC specifici pentru ambele subunitati si AMC care recunosc epitopii conformationali ai moleculei native.
AMC se folosesc in farmacologie. In scop profilactic se fac imunizari pasive fata de infectiile bacteriene care nu beneficiaza de preparate vaccinale si sunt rezistente la antibiotice: Pseudomonas, Clostridium.
in scop terapeutic, AMC se folosesc pentru tratamentul rabiei, pentru neutralizarea endotoxinelor (LPS) produse de infectiile cu bacterii Gram negative, consecutive arsurilor. Septicemiile sunt cauzate de o larga varietate de bacterii Gram negative, toate avand in comun lipidul A in structura chimica a LPS. Pentru tratamentul majoritatii infectiilor bacteriene se utilizeaza antibiotice, la un pret de cost inferior in raport cu AMC.
AMC se folosesc in controlul fertilitatii: AMC anti-HCG si anti-zona pelucida sunt folositi pentru imunizarea pasiva a femeilor fertile.
Speranta utilizarii AMC in tratamentul tumorilor s-a naruit. Una din cauze este ca majoritatea tumorilor umane isi au originea in celulele epiteliale ale colonului, sanului, plamanului si prostatei, iar oncogenele activate codifica proteine intracelulare, inaccesibile terapiei cu AMC. Frecventa acestor tumori nu creste la persoanele imunosupresate, ceea ce este un argument in favoarea codificarii antigenelor intracelulare, inaccesibile sistemului imunitar. Chimioterapia ofera mult mai multe sanse de succes, la un pret de cost inferior.
in sistemul hematopoietic si imunitar, AMC se folosesc pentru a distruge toate populatiile celulare, cu exceptia celulelor stern, cu scopul eliminarii celulelor malignizate si a precursorilor ei care poarta oncogena activata.
AMC se folosesc pentru neutralizarea nivelelor toxice ale unor medicamente (digoxina).
AMC se folosesc ca agenti imunosupresori. Receptorilor de grefa li se administreaza AMC specifici fata de complexul antigenic membranar CD3, in cazurile in care imunosupresia chimica (cu ciclosporina) nu reuseste.
in maladiile autoimune, AMC se administreaza pentru a realiza o imunosupresie partiala, care sa permita apararea fata de infectiile cu agenti oportunisti.
AMC se folosesc pentru producerea imunotoxinelor (conjugate AMC-medicamente). Medicamentele utilizate sunt agenti citotoxici, care, prin intermediul situsului de legare a AMC, sunt destinate sa se lege specific de celulele tinta(de exemplu, celulele maligne). In acest scop sunt necesari AMC cu o afinitate inalta a specificitatii de legare fata de antigene specific tumorale. AMC se cupleaza cu toxine (difterica, ricina, abrina), cu medicamente citostatice sau cu radionuclizi.
AMC se folosesc in tehnicile de biochimie analitica, in scopul purificarii proteinelor, sub forma coloanelor de afinitate imunoabsorbante. AMC sunt imobilizati pe suporturi in coloane solide (imunosorbenti), prin care este trecut amestecul de proteine. In coloana sunt retinute specific, moleculele care se leaga cu AMC. Astfel se purifica proteine care se gasesc in amestec, in concentratii foarte mici (IFN).