Gena c-jun este transcrisa imediat dupa stimularea celulelor cu mitogeni. Ea codifica

o fosfoproteina de 39 kD reprezentand componenta majora AP-1(proteina activatoare-1) a complexului de reglare transcriptionala

Din familia genei jun, pe langa c-jun, mai fac parte si genele jun-B si jun-D, ambele

fiind factori de transcriere cu un domeniu de transactivare N-terminal si unul de cuplare la DNA compus dintr-o regiune bazica si un motiv “zipper” leucina in capetele sale C-terminale.

Prin intermediul motivului “zipper” (leucinei), proteina Jun poate forma homo- sau heterodimeri ce vor cupla la DNA, exprimandu-si astfel functia de reglator transcriptional. Proteinele Jun pot forma heterodimeri si cu proteinele reglatoare ale transcrierii elaborate de alte gene cum sunt genele familiei fos, conditie in care raspunsurile transcriptionale vor diferi in timpul dezvoltarii si diferentierii celulare.

Rolul esential al genei c-jun ar fi in tranzitia din faza G0 in faza G1 a ciclului celular

pe care-l controleaza. Actioneaza asupra altor gene prin siturile AP-1 ale acestora, situri pe care le detine ea insasi in promotorul sau asupra caruia se poate actiona cu forbol ester (1).

AP-1 a fost prima proteina identificata ca factor transcriptional care recunoaste in promotorul genelor, situsul TRE (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetat response element). Desi c-jun si c-fos codifica componente ale factorului de transcriere ce stimulreaza expresia variatelor gene tinta in raspunsul la TPA (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetat), propria lor transcriere este indusa, de asemenea, dupa activarea PKC. In celulele umane, inductia mRNA c-jun de catre TPA, desi tranzitorie, dureaza mai mult decat inductia c-fos, transcriptul c-jun avand o stabilitate crescuta.

Cand complexul AP-1 controleaza expresia genelor implicate in proliferarea celulelor, expresia c-jun si c-fos creste rapid in numeroase tipuri celulare, ca raspuns la actiunea mitogenilor EGF, TGF-alpha, PDGF etc. Nivelele mRNA c-jun au o crestere logaritmica. Fiind un activator nuclear AP-1 cu componentele ei actioneaza direct pe genele implicate in crestere si diviziune necesitand semnale care vin in cascada din momentul cuplarii unui factor de crestere la un receptor de pe plasmalema celulei (2).

 

 

Factorii care influenteaza activitatea genelor jun

Factorii care influenteaza activitatea genei c-jun pot fi atat pozitivi cat si negativi. Astfel, silymarin, un flavonid polifenolic derivat din Silybum marinum, cunoscut ca un antiinflamator, citoprotector si anticancerigen, implica supresia NF-kB (factor de transcriere

nucleara) si regleaza diferite gene care intervin in inflamatie.

Silymarin nu afecteaza activitatea AP-1, dar inhiba activitatea PK indusa de TNF si

N-terminal c-jun kinaza, abrogand astfel citotoxicitatea TNF ca si activitatea caspazei (3).

Se sugereaza ideia ca, adenilat ciclaza pare a fi implicata in hiporeglarea expresiei

mRNA c-jun pe calea PKA. In plus,canalele de Ca²⁺ tip L, calmodulin si PKII-dependenta de Ca²⁺/calmodulin, pot fi partial implicate in hiporeglarea m-RNA c-jun indusa de forskalin (4).

Fibroblastele de soareci 3T3 derivate din fetusi lipsiti de c-jun, (principalul component al factorului de transcriere AP-1), in raspunsul celular la agentul alkilant metansulfonat (MMS), este cel mai potent si selectiv activator al JNK/SAPK ( kinaze induse de stres) si al p38, rezultand o foarte eficienta inductie a hiperfosforilarii si transcrierii genei.

Agentul alkilant induce apoptoza cu inalta eficienta in celulele tip-salbatic, dar nu in

cele c-jun-/-. Rezistenta la apoptoza este insotita si de expresia alterata a ligandului CD95 (CD95L), un cunoscut inductor al apoptozei. Adausul de rCD95L restaureaza sensibilitatea la apoptoza in fibroblastele c-jun-/- Apoptoza indusa de MMS in fibroblastele de tip-salbatic sau in leucocite umane este, puternic redusa prin neutralizarea ligandului cu anticorpi anti-CD95L. c-jun poate actiona ca un reglator pro-apoptotic in celulele expuse lezarii DNA via inductiei CD95L. Odata semnalizata moartea celulei indusa de CD95, aceasta nu este afectata de absenta c-jun, subliniindu-se faptul ca numai initierea si nu procesul apoptotic indus de stres depinde de c-jun

(5).

Calpoinele (cistein-proteaze citoplasmatice activate de Ca²⁺) actioneaza asupra

factorilor de transcriere c-fos si c-jun care raspund cu inalta sensibilitate. Integritatea structurala a monomerilor c-fos si c-jun nu este cruciala pentru a fi recunoscuta de calpoine (6).

JNK (c-jun-N-terminal kinaza) are diferite functii. Recent s-a aratat ca in plachetele ERK2 aceasta kinaza este activata de trombina si hiporeglata de angajarea integrinei beta(3)alpha (IIb). JNK-1 este prezenta in plachetele umane fiind activata de trombina, si fosforilata la concentratii scazute de trombina. In conditiile inhibarii cuplarii fibrinogenului la integrina alpha(IIb)beta(3) s-a demonstrat ca activitatea JNK-1 este reglata negativ.In premiera, s-a relevat ca MAP-kinazele si JNK-1 sunt reglate negativ de dispunerea integrinei (7).

N-4 hydroxy phenil retinamida (4-HPR), un analog al acidului retinoic induce apoptoza prin activarea sustinuta a JNK (c-jun-N-terminal kinaza) in linia celulara de carcinom de prostata -LNCaP p53+/+- care este sensibila la androgeni, dar nu in linia celulara PC-3 p53-/- care este insensibila la androgeni. Activarea JNK de catre 4-HPR este dependenta de caspaza, deoarece un inhibitor al acesteia opreste activarea kinazei.

Iradierea cu UV-C si UV-gamma induce activarea JNK in ambele linii celulare, sugerand ca imposibilitatea celulelor PC-3 de a raspunde la 4-HPR se datoreaza defectelor amonte de calea JNK. Curcuminul inhiba,de asemenea, activitatea JNK, concluzia fiind ca pe calea JNK se produce semnalizarea apoptotica declansata de 4-HPR (8).

Recent s-a identificat o noua PK activata de mitogeni (MAP-kinaza) care regleaza semnalul apoptotic (ASK-1) ce activeaza caile JNK (c-jun N-terminal kinase) si p38 MAP kinaza cu roluri pivotale in apoptoza indusa de TNF si Fas . Hiperexpresia ASK-1-DeltaN, o noua proteina MAP, activeaza JNK si induce apoptoza in celulele PC-12 diferentiate si in neuronii simpatici SCG (9).

c-jun contribuie la moartea neuronilor indusa de A beta (amiloidul beta). Totusi,

neuronii deficienti in c-jun sunt relativ rezistenti la toxicitatea cu acest amiloid.. In neuronii tratati cu A beta, in paralel cu schimbarile in expresia genei, se constata si o aparenta activare a promotorului c-jun, atat in cei deficienti in c-jun cat si in cei de tip salbatic. De asemenea, alte cateva gene cum sunt c-fos,fos-B, ngfi-B si I-kappaB au fost induse de A beta in neuronii de tip-salbatic (10).

jun-B. Expresia amplificata a acestei gene este mediata de alterarile factorilor cuplati

la elementul TATAA. Transcrierea ei amplificata se asociaza specific cu expresia v-src si nu poate fi reprodusa prin expresia unui vector c-src, v-Ha-ras sau v-raf. Mutatia punctiforma a elementului TATAA din gena jun B aboleste complet mutantele v-src sugerand ca proteinele cuplate la gena sunt modificate. Inductia ei este insa dependenta de activitatea crescuta a TK si de cuplarea ATP de catre proteina V-src. Se sugereaza ca proteinele src pot modula unii efectori nucleari pe cai ce implica produsele genelor celulare ras si raf. jun B, jun D si c-jun pot forma heterodimeri ce cupleaza la siturile specifice AP-1, dar difera in afinitatile de cuplare, relevand diferite activitati biologice si transcriptionale (11).

jun D. Sectionarea axonilor induce in pericarionul neuronilor, reactii morfologice, biochimice si functionale. Printre genele induse in acesti neuroni sunt si cele care codifica proteinele factorilor de transcriere; sunt asa numitele gene “de raspuns timpuriu” ce apartin familiilor jun, fos si krox ce sunt asociate cu cresterea si dezvoltarea sistemului nervos. G e n e l e

c-jun, jun D, krox-20 si krox-24 sunt prezente in sistemul nervos adult, chiar in absenta oricaror stimuli intentionali. In hipocamp si izocortex, proteinele “de raspuns timpuriu” aparute in urma unei epilepsii induse, expresia jun-D si fos-B se pastreaza 24 ore (12).

 

 

c-jun si v-jun in transformare

Oncogena v-jun a fost descoperita ca parte a genomului ASV 17, un retrovirus cu replicare defectiva, izolat din fibrosarcomul spontan de pui; in acest caz produsul oncogenei este cuplat cu produsul genei gag in proteina Gag-Jun de 65 kD. In intentia de a se elucida de ce la pui structura v-jun este neoplazica, aceasta s-a comparat cu c-jun, demonstrandu-se astfel ca, in jumatatea COOH-terminal a proteinei v-jun are loc substituirea a 2 aminoacizi, iar in jumatatea NH2-terminal are loc deletia a 27 aminoacizi. Pe langa aceasta deletie, secventele c-jun de la soarece si om au o substitutie aditionala de aminoacizi, fata de c-jun de la pui (2).

v-jun induce alterari marcate in fibroblastele transformate in ce priveste reglarea ciclului celular in prezenta sau absenta contributiei factorilor de crestere. In timpul cresterii asincrone, fibroblastele transformate de v-jun se divid mai repede decat cele normale, timpul fazei G1 a ciclului fiind substantial redus. Fibroblastele normale dependente de mitogeni serici ies din ciclu si intra intr-o sensibila stare de “liniste” (Go). Din contra, fibroblastele transformate de v-jun isi continua ciclul si mentin un nivel ridicat al blastomului, ca si cresterea expresiei markerilor dependenti de ciclul celular, respectiv ciclina A, CDK2 (PK dependenta de ciclina).

Fibroblastele transformate sunt total dependente de factorii de crestere necesari multiplicarii celulelor. In conditiile saracirii serului, progresia ciclului celular este insotita de rate inalte ale apoptozei. In conditiile depletiei mitogenului, v-jun manifesta capacitatea de a promota progresia ciclului celular si apoptoza , capacitate proprie oncoproteinelor myc, E1A si E2F (13).

Prin nivelele mRNA, expresia c-jun este masiv redusa in celulele transformate de v-jun, datorita scaderii ratei transcrierii. Scaderea reglarii transcriptionaele este evidenta, deoarece promotorul c-jun este de 10 ori mai putin activ in celulele transformate decat in cele normale. Reducerea este atribuita unui motif TRE-like conservat in pozitia -72 (TRE jun proximal), motif esential pentru expresia de baza, eficienta in celulele normale, dar care confera activitate transcriptionala redusa sau chiar absenta in celulele transformate .

Elementul TRE jun proximal este recunoscut de mixtura c-jun/Fra si de complexul cAMP-responsiv element-binding protein/activating transcriptor factor-like din celula normala. Expresia ectopica a v-jun represeaza activitatea promotorului c-jun in celulele normale, prin TRE jun proximal, astfel ca, deficitul de transcriere mediat de TRE jun in vivo se coreleaza cu cuplarea v-jun la acest element.

Promotorul c-jun este refractar inducerii pe calea activarii prin stres a PK/c-jun NH2-terminal kinaza in celulele transformate de v-jun, sugerand ca aceasta din urma interfera cu expresia genei care regleaza semnalul. c-jun reprezinta astfel, un exemplu de gena celulara a carei transcriere in vivo este reglata negativ de v-jun (14).

Stimularea activitatii transcriptionale a genei c-jun via fosforilarii mediata de MAP-kinazele activate de mitogeni, stres sau de c-jun NH2-terminal (SAPK/JNK) depinde de un situs -regiune delta- din kinaza scurtata a domeniului activarii NH2-terminal, deletata in derivatul oncogenic v-jun. Aceasta mutatie amplifica marcat oncogenitatea v-jun, desi consecintele ei transcriptionale nu sunt rezolvate; aceasta reflecta incertitudinea faptului ca SAPK/JNK ar inhiba direct functia c-jun sau ar facilita si mentine specificitatea fosforilarii reglatoare pozitiva.

c-jun devine activa cand se cupleaza la DNA via SAPK/JNK demonstrand ca acest proces nu exclude transactivarea. Se sugereaza ca SAPK/JNK activeaza primer ca un reglator pozitiv al transactivarii c-jun in situ si ca pierderea sitului scurtat fizic diminueaza activitatea c-jun (15).

v-jun ca si c-jun codifica o proteina ce cupleaza la DNA functionand ca factor de transcriere si este in acelasi timp componenta a complexului AP-1. Transformarea oncogenica prin v-jun este mediata de expresia aberanta a genelor tinta specifice. v-jun de lungime deplina a fost fuzionata cu forma sa NH2-terminal trunchiata la bindingul hormonal al receptorului estrogen uman. Cele doua proteine functioneaza ca transactivator ligand-inducibil. Expresia proteinei de fuziune in fibroblastele de pui determina transformarea dependenta de estrogen (16).

 

 

Genele tinta pentru proteinele Jun

Proteinele nucleare de transcriere actioneaza asupra promotorilor si enhancerilor diverselor gene carora le stimuleaza expresia. Proteina Jun actioneaza in complexul AP-1 dar si independent, fapt demonstrat recent. Astfel, JTAP-1-(o gena cathepsin-like) este inalt reglata ca raspuns la actiunea v-jun inducand transformarea celulara. Ea se hiperexprima de 7-10 ori in celulele CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) transformate de v-jun, comparativ cu hiperexpresia din celulele normale,

Omologia DNA si a aminoacizilor releva ca JTAP-1 este inalt similara cu peste 100 cistein-proteaze dintr-o varietate de specii si este asemanatoare cu omologul de la pui-cathepsina O-. Analiza expresiei in CEF a genelor v-Ha-ras, v-src, c-fos si myc in acelasi timp cu JTAP-1 releva ca hiperexpresia acesteia este unica in toate celulele transformate de

v-jun. Astfel ca, JTAP-1 este o tinta specifica a v-jun hiperexprimata si nu o simpla consecinta a transformarii celulare (17).

Studiindu-se rolul semnalizarii PK indusa de EGF si factorul de transcriere c-jun in celulele carcinomului epidermal uman A413, s-a constatat expresia genei 12-lipoxigenazei. EGF creste activitatea ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) si JNK (NH2-terminal Kinaza c-jun).

Hiperexpresia c-jun amplifica expresia mRNA 12-lipoxigenazei si activitatea enzimei. Siturile Sp1-binding din regiunea promotor a genei 12-lipoxigenazei sunt necesare pentru activarea prin (legare) c-jun. Inductia ultima a c-jun prin activarea ERK si JNK este esentiala pentru acest raspuns (18).

Apolipoproteina A-1 este tinta negativa a hipoexpresiei v-jun. Hiporeglarea expresiei genei apolipoproteinei A-1 se face prin efectul asupra promotorului activ. O diminuare similara a reglarii acestei gene o poate determina myc si v-src, dar nu c-fos, v-Ha-ras, c-src sau c-ski. V-jun poate avea un efect potential reglator metabolic si asupra colesterolului (19).

 

 

Gena fos

Proteinele Fos declanseaza transcrierea unor gene, motiv pentru care sunt considerate proteine nucleare ce ocupa ultima treapta in cascada transmiterii semnalelor de la membrana celulei la DNA. Asociata cu proteina Jun, proteina Fos formeaza complexul AP-1 descoperit initial ca proteina care initiaza si declanseaza transcrierea unor gene.

Gena fos se exprima in timpul cresterii si diferentierii celulare. Proteinele familiei Fos sunt: c-Fos, Fos-B, Fra-1 si Fra-2. Dupa dimerizarea cu proteinele Jun, le creste atat afinitatea de cuplare cat si activitatea de transcriere. Proprietatile diferentiate ale heterodimerilor, ca si diversele interactiuni combinate ale proteinei Fos extind considerabil spectrul potential si specificitatea functiilor reglatoare ale acesteia.

Soarecii lipsiti de gena c-jun functionala mor, in parte, la mijlocul gestatiei, ceea ce demonstreaza ca c-jun este esentiala petru dezvoltarea normala. Cei care supravietuiesc au insa, defectiuni in osteogeneza, gametogeneza, neurogeneza si hematopoieza.

Protooncogena c-fos detine componente omoloage cu oncogena v-fos componente intrerupte de 4 regiuni introni, absente in genomul virusurilor purtatoare ale oncogenei. Atat la soareci cat si la om exista o regiune de 104 nucleotide care reprezinta secventele deletate in timpul biogenezei v-fos.

Proteina c-Fos este formata din 380 resturi de aminoacizi, remarcabil de similari cu ai proteinei v-Fos care este formata din 381 resturi de aminoacizi. Gena c-fos detine inca 104 nucleotide aditionale, care insa nu cresc dimensiunea transcriptelor. Primii 332 de aminoacizi ai proteinelor c-Fos si v-Fos de la soareci, difera numai in 5 reziduuri, in timp ce in ceilalti 48 aminoacizi, diferentele sunt mai mari si in consecinta, COOH-terminali ai celor doua proteine difera.

Genele de la soarece si om au peste 90% secvente omoloage, diferind numai in 24 reziduuri din totalul de 380. Virusul FBR (Finkel-Biskis-Reilly) MSV (Murine Sarcoma Virus) are genomul format din 3791 nucleotide care codifica un singur produs de fuziune gag-fos de 546 aminoacizi. Oncogena v-fos a osteosarcomului FBR induce tumori mezenchimale( osteosarcom, rabdomiosarcom, condrosarcom, liposarcom) si inhiba adipogeneza.

Virusul FBJ (Finkel-Biskis-Jinkins) (MSV-Murine Sarcoma Virus), care poarta

v-fos induce, de asemenea, osteosarcom. DNA proviral FBJ contine 4026 nucleotide ce includ 2 LTR de 617 nucleotide fiecare, 1639 nucleotide din secventele celulare c-fos si un segment din anvelopa virionului-gena env. Codoanele initial si terminal ale genei v-Fos detin secvente dobandite care codifica o proteina de 381 aminoacizi, cu greutatea moleculara de 49.601.

In celulele transformate de FBJ-MSV s-a identificat pe electroforeza in gel poliacrilamida de SDS, o fosfoproteina transformanta de 55.000

 

 

Inductibilitatea genei fos

Ca raspuns la mitogeni sau agenti specifici, gena fos este indusa rapid, la cateva minute de la adausul inductorului aparand transcripte specifice c- fos. Frecvent, inductia este tranzitorie si precede in general, inductia altor proteine nucleare cum este si proteina genei myc. Dupa inductia cu TPA sau cu vitamina D3, gena c-fos se exprima in celulele U937 (linie promielocitica) sau in celulele HL-60 (linie monomielocitica), in 1-3 minute cu maximun la 30 minute. Nivelele transcriptiei genei declina in proportie de 20-25%, dar raman neschimbate 10 zile. Proteina c-Fos necesara diferentierii mieloide se exprima numai 2 ore, nivelul maxim fiind atins la o ora.

Cand fibroblastele”linistite” sunt tratate cu ser sau cu factorii de crestere PDGF, EGF, TPA (ester forbol), c-fos este indusa in 2-3 minute, cu nivele maxime (de peste 20 ori) la 20 minute si cu declin la o ora (20).

Prelucrarea celulelor NIH3T3 cu acesti factori de crestere, initiaza expresia genelor timpurii, printre care si c-fos, care la randul ei activeaza expresia altor gene, cum este si gena transin. Stimularea cu TPA a acestei gene reduce expresia ei cu 50% si aceasta prin micsorarea selectiva a proteinei Fos.

Prin receptorii lor, PDGF si EGF interactioneaza cu segmentul reglator TGAGTCA localizat in regiunea promotoriala a genei transin. Acest segment este de fapt, un situs de legare a factorului de transcriere AP-1, in care componenta de baza este proteina Fos. Stimularea expresiei genei transin cu PDGF este blocata prin reducerea selectiva a proteinei Fos (21).

EGF determina cresterea marcata a mRNA c-fos si c-myc in cultura primara de celulele tiroidiene. Nivelul maxim este atins dupa 30 minute de la adausul de EGF, in timp ce nivelul mRNA c-myc creste dupa 30-60 minute cu un maxim atins la 90 minute (22),

Gena c-raf codifica o serin/treonin kinaza numita Raf-1 care raspunde de semnalele transmembranare si care in forma mutanta capata proprietati transformante. Proteina v-Raf, partenerul oncogenic al c-raf-1 poate transactiva transcrierea a doi promotori inductibili timpurii si anume: proteina c-Fos din celulele umane si murine si promotorul genei umane beta-actina (23).

Substantele care maresc concentratia intracelulara de cAMP conduc rapid si tranzitoriu expresia c-fos in celulele soarecilor. In promotorul acestei gene sunt elemente care participa la raspunsul cAMP in testul tranzitor. Situsul de legare, de baza al promotorului este localizat in 65pb din segmentul de initiere a transcrierii si corespunde cu situsul CRE la care se cupleaza diferiti factori celulari. cAMP induce astfel expresia c-fos in melanocite, gena stimulata la randul ei de toxina holerica si de NGF (24,25).

Spre deosebire de IFN-gamma, IL-1 si TNF induc nivele marcate ale expresiei genei fos in celulele endoteliale umane in cultura. Nivelul maxim de mRNA apare la o ora dupa

stimularea cu IL-1 si la 4-7 ore efectul dispare (26).

In urma incubarii cu angiotensina II-polipeptid care declanseaza constrictia vaselor,

in celulele musculare netede ale aortei de sobolan se produce o crestere rapida a nivelului m R N A

c-fos, care atinge maximum dupa 30 minute, ulterior scazand. Un efect similar asupra nivelului mRNA c-fos are si serul fetal de vitel. Angiotensina II stimuleaza expresia genei c-fos prin intermediul unor mediatori intracelulari cum sunt PKC si Ca²⁺ (27).

Inducerea protooncogenelor fos si sis, ca si a genelor proteinelor matricei extracelulare de catre butirat in procesul diferentierii gliomului F-98 la sobolan, nu influenteaza mRNA Ki-ras. Butiratul induce astfel reversibil mRNA fibronectinei si colagenului (28).

In linia celulara PC12 de feocromocitom s-a studiat biochimia mecanismului de inductie a expresiei genei c-fos, constatandu-se ca acesta depinde de stadiul activitatii de diferentiere si proliferare celulara. Agentii care depolarizeaza neuronii induc c-fos pe calea deschiderii canalelor de Ca²⁺. Se conclude ca, inducerea c-fos se realizeaza nu numai pe calea interactiunii “receptor-ligand” ci si cu agenti depolarizatori sau prin interactiuni care influenteaza canalele pentru Ca²⁺ (29).

Virusurile sau unele proteine ale acestora, au capacitatea de a transactiva expresia genelor celulare endogene legate de procesul de proliferare celulara. Proteina p40^tax a virusului HTLV-I determina expresia protooncogenei c-fos care codifica sinteza proteinei c-Fos, in contrast cu nivelul neschimbat al mRNA altor gene cum sunt c-myc, c-myb si c-jun.P40^tax joaca un rol important in transformarea limfocitelor T.

Produsul genei BZLF-1 din EBV numit ZEBRA este o proteina ce cupleaza la DNA si este partial omoloaga cu c-fos, la randul ei cupland specific la siturile AP-1; aceasta proteina poate induce ciclul litic al limfocitelor B infectate latent. ZEBRA poate induce astfel, e x p r e s i a

c-fos prin siturile AP-1-like prezente in promotorul genei c-fos.

Inducerea transcrierii c-fos incepe dupa o ora de la infectarea cu VSH-2 si atinge

maximum dupa 3 ore, iar dupa 24 ore se opreste complet. Inducerea c-fos in celulele L929 determina aparitia a doua transcripte nucleotide, iar in celulele W138 (celule umane diploide), numai un transcript.Pentru inducerea c-fos este obligatorie sinteza proteinelor virale (30, 31, 32).

Expresia protooncogenei c-fos apare si in procesul cresterii dupa 30-40 minute, si dupa 4 ore posthepatectomie. Gena c-myc se exprima timp de o ora si apoi dupa 6-8 ore. Se subliniaza expresia diferentiata a genelor studiate in fazele prereplicative ale hepatocitelor (33). Astfel, gena c-fos este indusa tranzitoriu in diferite linii celulare in cultura, de catre numerosi stimuli celulari, totusi, unii autori sustin ca gena c-fos este constitutiv transcrisa in diverse celule printre care si cele limfoide (34).

In procesul formarii encefalului la sobolan, s-a demonstrat ca in perioada de dezvoltare rapida a embrionului si pana la a 16-a zi postnatal mRNA c-fos are un nivel foarte scazut. Se apreciaza ca gena c-fos nu participa la reglarea mitozei in perioada postnatala timpurie, pentru ca ulterior sa joace un rol important in dezvoltarea functionala a tesutului nervos cerebral (35).

In ultimul timp s-a acordat o mare atentie genei c-fos si expresiei ei in celula nervoasa. Expunerea la un mediu conditionat anterior cu amfetamina (1mg/Kg i.p.) induce expresia c-fos in cortexul frontal, expresie considerata un marker pentru activitatea neuronilor.

Administrarea acuta si repetata a amfetaminei induce expresia aditionala a c-fos si in nucleul accumbens (36).

Injectarea subcutana a formalinei (50 micromoli, 10%) la sobolani masculi creste activitatea c-fos in gyrus dentatus (DG1 si campurile CA3), iar la femele, nivelele c-fos sunt mai scazute in campurile hipocamapale (37).

Injectarea formalinei diluate in peretele colonului reduce expresia fos in neuronii mienterici si in glia enterica, in neuronii maduvei spinarii si in cei din trunchiul cerebral, ceea ce s-ar datora stimularii chimice directe a colonului si/sau colitelor acute ulceroase (38).

Proteina c-Fos se modifica in maduva spinarii de la sobolanii carora li s-a grefat adenocarcinomul de prostata- MAT-Ly Lu- in membrele posterioare. Marcajul cel mai dens al fos apare in segmentul L3-L5, pe aceeasi parte a membrului grefat. Marcajul detectat la 5 zile creste pana la 10 zile si apoi scade. Coarnele ventrale ale maduvei sunt cel mai dens marcate. Se demonstreaza ca semnalele sunt transmise de tumora spre sistemul nervos central inclusiv maduva spinarii care reflecta o stare de durere (39).

 

Fos in AP-1

Genele fos si jun codifica proteine nucleare care participa la reglarea transcrierii altor gene. c-Fos si c-Jun formeaza complexe proteinice care interactioneaza specific cu elemetul reglator de legare via cunoscutului complex AP-1. Desi jun se poate cupla la DNA in absenta lui fos, prezenta acesteia mareste viteza de cuplare pe baza stabilizarii complexului DNA-proteina. Pentru formarea complexului fos-jun raspund 7 resturi de leucina. Cele doua proteine Fos si Jun formeaza heterodimeri care se leaga cu mai inalta eficienta la promotorul genelor ce detin situsul AP-1. Proteina Fos actioneaza in sensul reglarii transcriptionale, prin domeniile de la capatul

C-terminal (40, 41).

AP-1, complex constituit din p-c-Jun si p-c-Fos regleaza transcrierea promotorilor ce

contin elemente de cuplare activatoare de tip AP-1-like. C-Jun are activitate de legare a DNA,

iar c-Fos este omoloaga in domeniul de legare a DNA cu c-Jun. In vitro, c-Jun se leaga la DNA ca homodimer la situl AP-1, pe cand c-fos nu poate dimeriza si nu detine afinitate pentru elementul AP-1. Proteinele translatate c-Jun si c-Fos se leaga la DNA AP-1, de 250 ori mai eficient ca heterodimeri, decat o fac cu homodimerii c-Jun. Astfel, c-jun cupleaza la DNA ca iar

dimer, la c-fos, in calitate de partener natural. In hiperexpresia proteinei c-Jun in absenta c-Fos, se pot produce homodimeri aberanti ai complexelor transcriptoare, care pot altera mecanismele normale de control ale expresiei genelor (42).

 

Transformarea prin proteinele Fos

Transformarea prin proteina c-Fos poate fi realizata daca este alterat domeniul codificat pentru cuplare COOH-terminal. Cand transcrierea genei c-fos este indusa cu diversi agenti intr-o varietate de tipuri celulare, proteina c-Fos este sintetizata tranzitoriu. Pentru transformarea celulara este obligatorie o sustinuta sinteza a proteinei c-Fos.

Datorita deletiei a 104 pb in timpul biogenezei v-fos, proteina v-Fos are un COOH-terminal alterat, asa incat ea se va sintetiza constitutiv, inducand transformarea. Astfel, p55^fos elaborata de FBJ-MSV cat si p75^gag-fos elaborata de FBR-MSV induc transformarea

morfologica mai pronuntata in ultimul caz. Desi p75 gag-foseste o proteina de fuziune, componenta gag nu pare sa influenteze abilitatea transformanta a proteinei (20). Virusul himeric FBR caruia i s-a deletat gena gag pastreaza un inalt potential transformant caracteristic, astfel ca gena gag nu participa la elaborarea proteinei transformante (43).

Proteinele c-Fos sunt de 4-5 ori mai fosforilate decat proteinele v-Fos. Ambele detin cateva fosfopeptide generale, dar proteina c-Fos contine si unele importante fosfopeptide unice, care insa lipsesc din proteina v-Fos. Aceste situri unice ale fosforilarii c-Fos sunt localizate la capetele COOH (ultimii 20 aminoacizi). Fosforilarea proteinei c-Fos si nu a proteinei v-Fos este stimulata de 5 ori in vivo cand celulele sunt tratate cu ester forbol. Nivelul fosforilarii c-Fos este independent de PKC (20).

Lezarea DNA este o manifestare centrala a carcinogenezei. Agentul care lizeaza DNA activeaza un numar de cai de transductie a semnalelor ce duc la repararea DNA, apoptoza sau la amplificarea ciclului celular. O celula cu DNA deficient reparat este mai expusa la mutatii care promoteaza cancerul. FBR-v-fos, omologul retroviral al protooncogenei c-fos inhiba raspunsul celulei la radiatii. Celulele care exprima acest omolog retroviral au abilitate redusa in ce priveste repararea DNA lezat de radiatii, astfel incat ele supravietiesc putin postiradiere. In

plus, FBR-v-fos inhiba PK dependenta de DNA, o kinaza specifica activata dupa expunerea celulelor la radiatii. Aceste efecte sunt specifice pentru radiatiile ionozante, dar nu si pentru cele ultraviolete; efectele sunt dependente de modificarea unui lipid reclamat pentru tumorogeneza

indusa de FBR-v-fos miristilata. O mutanta nemiristilata nu are efect. Oncogena retrovirala poate conduce la instabilitate genica crescuta, ceea ce amplifica potentialul oncogenic al celulei.

FBR-v-fos inhiba multiple diferite cai de diferentiere; in vitro inhiba cresterea si diferentierea terminala a adipocitelor si activitatea proteinei c/EBP alpha , un reglator cheie al acestei diferentieri, reglator care se poate implica in generarea liposarcoamelor (44, 45).

FBJ-virusul sarcomului murin poarta v-fos si induce osteosarcomul. Expunerea soarecilor transgenici la nivele inalte de c-fos conduce la aparitia postnatala a tumorilor osoase, respectiv cartilaginoase.

In primordiile prezumtive ale picioarelor embrionului de pui aflat in stadiul 10 s-a indus ectopic oncogena fos, prin microinjectarea retrovirusului competent de replicare. Consecinta a fost trunchierea cartilajelor tuturor oaselor lungi, cu condrodisplazie datorata retardarii severe a diferentierii condrocitelor proliferative in condrocite mature sau hipertrofiate, ca si o usoara intarziere a condensarii precartilaginoase.

Expresia genelor tuturor membrilor cunoscuti ai AP-1 de la pui ce includ si genele transformante c-jun si fra-2 nu induc totusi anomalii macroscopice in formarea membrelor sugerand ca o fractie specifica a proteinei Fos intervine in diferentierea osului embrionar endocondral. Extinderea trunchierii este mai marcata in cazul v-fos decat al c-fos. Se releva ca activitatea transformanta a proteinei Fos este necesara pentru inducerea displaziei, sugerandu-se faptul ca mecanismele moleculare comune sunt implicate atat in condrodisplazia embrionara cat si in formarea tumorilor oasoae (46).

Celulele osoase sunt o prima tinta pentru functia biologica a complexului factorilor

de transcriere fos/jun (AP-1). Expresia dereglata a c-fos sau v-fos in celulele osoase induce tumorogenitate si deci aparitia osteosarcomului non-metastazic. Din contra, oncogena v-fos transforma fibroblastele intr-un fenotip invaziv insotit de expresia divereselor gene asociate invaziei si metastazarii. Activitatea sustinuta a AP-1 se pare ca nu este suficienta pentru

inductia in celulele osoase transformate a genelor asociate invaziei si metastazarii dependente de complexul AP-1. S-au identificat promotorii genei colagenazei I si a stromelizin-1, ca mijloace utile pentru analiza altor factori care regleaza progresia metastazarii osteomului (47).

Fibroblastele transformate de oncogenele v-fos arata expresia crescuta a unui numar

de gene implicate in invazia celulelor tumorale si in metastaza. In contrast cu fibroblastele normale de sobolan-208F-, celulele transformate de fos sunt independente de factorul de crestere pentru invazie. Invazia celulelor transformate de v-fos sau EGF reclama activitatea AP-1 si este inhibata de oligonucleotide antisens c-Jun si de expresia unei mutatii negative dominante c-jun -TAM-67-.Invazia indusa de EGF este inhibata de oligonucleotidele antisens c-Fos si c-Jun. Se avanseaza ipoteza ca rolul AP-1 in transformare este de a activa programul invaziei multigenice (48).

 

Gena fra-2

Gena fra-2 este inrudita cu protooncogenea c-fos codificand un membru al familiei

fos, element component al factorului de transcriere AP-1. Fra-2 este o gena distincta de alte gene fos deoarece are un rol unic in diferentierea celulara din perioada fetala. Ea este activa in organogeneza tarzie, fapt demonstrat imunohistochimic. Transcriptele fra-2 sunt prezente in cateva epitelii diferentiate, in cartilaje si in sistemul nervos in dezvoltare.

In a 16-a zi de dezvoltare embrionara, fra-2 este detectata in straturile bazal si granulos ale epidermei, dar nu in cele cornificate. In a 17-a zi este detectata, de asemenea, in cartilaje dar si in oasele in dezvoltare. Nivele inalte se exprima si in tesutul cromafin din medulosuprarenala, in cortexul embrionar dar si in creierul matur la nivelul putamenului, hipotalamusului si hipocampului (49).

 

c-jun and c-fos protooncogenes

Ap-1 was originally identified as a TPA-inducible DNA-binding factor that stimulated transcription of the simian virus 40 (SV40) enhancer. Purification of the ywo major proteins present in AP-1 revealed to be encoded by two different proto-oncogenes: c-jun, the cellular homologue of v-jun oncogene of ASV 17 (aviansarcoma virus 17), and c-fos, the homologue of v-fos oncogene of FBJ (Finkel-Biskis-Jinkis) murine osteosarcoma virus. Both c-jun and c-fos can be activated as transforming genes by overexpression of normal genes.They can be rapidly induced in a large number of different cell types by a variety of factors, including growth factors and are immediate early response genes.

Like other nuclear oncogenes, there are multiple jun and fos- related genes, jun-B and jun-D from the jun familiy and the fra-2 gene related to c-fos, the latter being involved in cell differentiation during development. All these genes encode proteins that are capable of dimerization and have a specific sequence for DNA binding.

Structural analysis of c-jun encoded protein,which is 340 amino acids, revealed that

i s

C-terminal end contains a leucine zipper motif (for dimerization), a bosic region (for DNA binding) and trnsactiivation domain. The N-terminal and of the protein contains a regulatory domain which is absent in v-jun encoded protein . Phosphorylation of N-terminal region is associated with increased DNA binding and transcriptional activity. The jun proteins can form homodimers which are transcriptional activators or can associate with c-fos proteins to

form heterodimers which are less eficient as transcriptional activators. The c-jun proteins can act whithin the AP-1 complex and as well as independently in influencing the expression of other genes.

C-fos protein, which is 381 amino acids, is similar but not identical, to that of c-jun protein in that it contains the basic region and zipper motif that is differently located in the protein structure. Unlike c-jun proteins,c-fos encoded proteins are unable to form stable homodimers.

The Jun and Fos proteins form heterodimers with other transcription factors related proteins of CREB family (c-AMP responsive element binding factors). C-jun and c-fos expression is differently influenced by other protooncogenes encoded proteins such as Ras, Raf and Src.

Transformant activity of v-jun and c-jun has been demonstrated in a variety of cell types. Fibroblasts transformed by v-jun are able to divide more rapidly than their normal partners and are dependent on growth factors. C-jun mRNA expression is negative regulated in cells transformed by v-jun.

Transformation by c-fos depends on a sustained synthesis of the protein and on the presence of an altered binding domain. C-fos proteins are 4-5 fold more phosphorylated than v-fos proteins. V-fos proteins are able to inhibit diveerse differentiation pathways, are involved in carciniogenesis of liposarcoma and osteosarcoma. Fibroblasts transformed by v-fos show a increased expression of genes involved in invasion and metastasis of tumoral cells.

 

 

GENELE FAMILIEI ETS

(Eritroblastoza)

Genele ets codifica factori de transcriere care recunosc secventele GGAA prezente

in variate elemente promotor/enhancer celulare si virale, activand transcrierea pe calea cuplarii la aceste secvente. Genele ets sunt implicate in reglarea dezvoltarii si se exprima intr-o varietate de celule inclusiv hematopoietice.

La pui, gena ets-1 se exprima prin proteina p54^c-ets-1 si prin proteina p68^c-ets-1, proteine care difera in capatul N-terminal datorita procesarii alternative. P-68 c-ets-1 se

exprima in celu