Genele familiei MYC sunt: c-myc, L-myc si N-myc codifica proteine cu localizare nucleara si cu rol de reglatori ai transcriptiei (1). Alaturi de genele fos si jun (gene de raspuns timpuriu) a caror expresie este indusa foarte rapid ca urmare a cascadelor de fosforilare declansate prin activarea receptorilor factorilor de crestere induc transcrierea unor gene.

Toate genele familiei MYC codifica fosfoproteine de aproximativ 60 kD exprimate

atat in celule normale cat si in celulele transformate malign in cazul in care expresia lor este dereglata. Capatul N-terminal al proteinelor Myc contine un domeniu de transactivare transcriptionala. Capatul C-terminal contine semnalul de localizare nucleara si urmatoarele situsuri: regiunea bazica, “helix-loop-helix” si “leucine zipper”, de unde si denumirea grupului, de factori transcriptionali ca proteine b HLH L Zip.

Regiunea bazica este implicata in legarea Myc la secvente specifice de DNA, in timp

ce motivele HLH si Lzip sunt necesare pentru interactiunile proteina-proteina ale lui Myc, interactiuni fara de care aceasta nu poate forma homo- sau heterodimeri si in consecinta, nu-si poate exprima functia de transactivator transcriptional (2).

Reglarea nivelului expresiei Myc in celulele normale este asigurata prin diverse mecanisme. Nivelul bazal al Myc mRNA este semnificativ ca raspuns la stimuli externi cum sunt factori de crestere sau ca raspuns la activarea altor oncogene celulare. Se admite ca unul din aceste mecanisme, considerat si principal, consta in elongarea transcriptionala (3). Un alt mod de reglare deriva din turnoverul, foarte rapid in mod normal, al mRNA si proteinei Myc.

Proteinele Myc isi autoregleaza productia, desi datele in acest sens sunt contradictorii. Toate mecanismele de control insa, au rolul de a mentine nivelul lui Myc intre anumite limite si de a-i regla expresia inalta in timpul stimularii celulelor dorminde pentru a le determina intrarea in ciclul celular.

Protooncogenele myc si proteinele pe care le codifica implica o mare varietate de anomalii in expresia si functia lor in procesul transformarii. Myc a fost descrisa initial ca oncogena virala, intr-o serie de tulpini virale care afecteaza predominant celulele mieloide si macrofagele, inducand diverse tipuri de leucemii la pasari. Produsul genei v-myc din retrovirusul avian MC-29, a fost prima proteina descoperita, proteina codificata de oncogena virala localizata nuclear si cu capacitate de legare la DNA (4). Oncogena v-myc releva omologii cu protooncogena c-myc din genomul celulelor aviene si mamaliene. Astfel, v-myc MC-29 se omologheaza cu exonii 2 si 3 din gena c-myc (5).

 

 

 

Activarea genei c-myc

Activarea insertionala.

Activarea insertionala este una din modalitatile de declansare a transcrierii genei c-myc, respectiv integrarea in genomul celular a unui genom retroviral integru sau partial. Retrovirusurile cu potential de replicare pot induce o varietate de tumori prin activarea insertionala a genelor celulare; aceasta presupune ca virusul nu detine o oncogena, ceea ce nu

este cazul retrovirusurilor care detin o oncogena si produc transformarea celulelor direct, “independent”. Astfel, in cazul virusului ALV, DNA proviral se integreaza in DNA celular. Prin integrarea provirusului sau a fragmentelor lui, prin fragmente de jonctiune se realizeaza clonarea moleculara a DNA viral-DNA celulei gazda. In celulele tumorale o asemenea recombinare determina activarea unei gene celulare care ofera un avantaj de crestere.

Mecanismul activarii genelor celulare de catre provirusul integrat este divers, dar intotdeauna legat de proprietatea retrovirusului de a poseda semnalele transcrierii. S-a propus ca LTR din dreapta al unui provirus integrat, sa serveasca direct ca promotor transcriptional al unei gene, promotor dependent de elementul proviral. Acest model de insertie a promotorului viral este valabil pentru multiple limfoame bursale induse de ALV, de unde sugestia ca multe, daca nu chiar toate provirusurile din vecinatatea lui c-myc ar detine deletii extinse ale genomului viral, asa incat, in unele cazuri nu ramane decat un LTR solitar, intact. Alteori, in celulele tumorale, provirusul ALV ar putea apare independent de c-myc sau in orientare inversa. Aceasta forma indirecta a activarii transcriptionale a indicat cresterea enhancerilor transcriptionali ai LTR retroviral.

Activarea insertionala nu este unica pentru gena c-myc, deoarece asemenea integrari sunt cunoscute si pentru numeroase alte gene si retrovirusuri. Se subliniaza ca integrarea retrovirala are o anumita specificitate pentru secventele de DNA celular sau pentru structura cromatinei (6).

In numeroase lucrari experimentale sunt prezentate variante de integrare. Astfel, s-a stabilit ca numai genele myc cu promotor din LTR localizat intre promotorul nativ (c-myc) si al doilea exon are functie transformanta in celulele embrionare de prepelita. LTR poate astfel transforma gena myc intr-o gena transformanta pentru celulele embrionare, numai in conditiile in care se cupleaza intr-o anume pozitie determinata (7).

Analiza clonei moleculare care contine gena c-myc releva ca DNA-ALV se integreaza in “dreapta” fata de c-myc cu 575 perechi nucleotide ce reprezinta segmente din interiorul portiunii netranslatabile, impiedicand astfel folosirea semnalului normal al poliadenilarii (8). Concluzia este ca inducerea cu ALV a limfomului celulelor B este determinata de insertia provirusului in gena celulara c-myc. In 66 din 68 cazuri de limfoame induse de ALV, integrarea genomului viral se face in gena c-myc, iar 64 din ele au aceeasi orientare transcriptionala. Toate provirusurile inserate s-au integrat fie in primul exon fie in primul intron al genei myc si, de asemenea, toate au avut deletii care au inclus segmente din vecinatatea lui 5’LTR. Majoritatea provirusurilor au pastrat ambele LTR (3’ si 5’) dar au pierdut segmente de langa 5’LTR.

Analiza a 24 situri de insertie arata ca aceasta se face pe o distanta de 3000 kb, nemijlocit “ stanga” fata de segmentul de codificare c-myc (9). MoMuLV (virusul leucemiei murine Moloney) care declanseaza aparitia timomului la sobolan se leaga partial la exonul 1 c-myc prin 5’LTR, orientarea acestuia fiind inversa transcrierii c-myc (10).

 

Amplificarea genei myc

Amplificarea specifica a genelor este implicata intr-o varietate de raspunsuri adaptative ale celulelor, la stresurile mediului. In celulele tumorale si in cele selectate pentru rezistenta la droguri, s-au stabilit modalitati citogenetice de amplificare genica, printre care minicromosomii ce apar in metafaza si care sunt asemanatori perechilor de cromosomi, (dar

carora le lipseste un centromer) si regiunile cromosomale omogen colorate (HSR - Homogenous Staining Chromosomal Regions).

Aceste anomalii citogenetice sunt forme alternative ale amplificarii genei, amplificare care poate merge de la cateva ori, la peste sute de ori. In celulele leucemice premielocitice

HL-60 gena c-myc se amplifica de 8-32 ori situatie care se regaseste si in celulele leucemice primare ale pacientilor.

In carcinomul de colon de la om (COLO 320) c-myc prezinta pana la 30 copii. Alterarile structurale ale genelor preced amplificarea lor sau se obtin in timpul amplificarii. In acest tip de carcinom sunt amplificate atat versiunile normale cat si cele alterate ale genei myc.

In unele celule tumorale, oncogenele amplificate pot complementa pe cele activate mutational. Gena N-myc este consistent amplificata in majoritatea liniilor celulare de neuroblastom - tumora pediatrica fatala. Dimensiunea ampliconului in aceasta tumora poate fi de ordinul a 200-2000 kb si contine secvente distincte din bratul cromosomal 2q. Aproximativ 50% din neuroblastoamele aflate in stadiile avansate de evolutie (III,IV) contin oncogena N-myc amplificata.

Amplificarea genica nu este un proces initiator al carcinogenezei. Amplificarea si cresterea expresiei c-myc si N-myc apar in timpul progresiei maligne a carcinomului pulmonar uman, ca si in celulele neuroblastomului. Probabil amplificarea unei gene afecteaza progresia maligna a celulelor deja initiate. In unele cazuri, chiar oncogenele amplificate pot deveni transcriptional “linistite” dupa inductia diferentierii tumorale (11).

Amplificarea genelor celulare ramane totusi, unul din mecanismele celulare adaptative genetic, mecanism necesar pentru capacitatea de sinteza a mari cantitati de produse celulare specifice. Amplificarea neprogramata a genelor implicand domeniile DNA extensive este un proces frecvent prin care celulele capata rezistenta la drogurile selective, in timp ce amplificarea programata poate apare in unele faze din timpul dezvoltarii normale, asa cum este cazul celulelor foliculilor ovarieni ai mustei de fructe.

In neuroblastom, DNA amplificat este parte a genei c-myc, omologul celular al lui v-myc. Aceasta noua secventa de DNA a fost numita N-myc. Din 26 linii celulare de neuroblastom, 22 arata N-myc amplificat in proportie de 10-700 ori, iar celelalte 4 linii nu arata amplificare. In toate cazurile insa, amplificarea lui N-myc este detectata in minicromosomi si HSRs. Frecvent, amplificarea se detecteaza in stadiile III si IV, ceea ce presupune ca aceasta reprezinta un fenomen tarziu in evolutia neuroblastomului. In mod normal, N-myc este localizata pe bratul scurt al cromosomului 2 (2p23-24), in timp ce HSRs, s-au detectat pe numerosi diferiti cromosomi. Nu este clar daca N-myc este translocata inaintea amplificarii sale, sau daca aparitia unor HSRs in diferite pozitii cromosomiale reprezinta rezultatul amplificarii prior.

Amplificarea genei N-myc apare atat in neuroblastom cat si in cancerul pulmonar cu celule mici. In acest ultim caz, amplificarea genei este asociata cu forme mult mai agresive ale tumorilor (12).

Amplificarea acestei gene de pe cromosomul 2 din celulele neuroblastomului uman stimuleaza cresterea, ceea ce ofera avantajul proliferarii, fenomen de altfel comun multor tumori. In tumorile metastazice amplificarea locusului N-myc este un fenomen dominant (13).

Atat liniile celulare cat si tumorile de neuroblastom se disting prin exprimarea scazuta a HLA clasa I, majoritatea aratand oncogena N-myc amplificata. Totusi, nu totdeauna rata scazuta de crestere a HLA clasa I in celulele tumorale, se coreleaza cu expresia c-myc. O corelatie inversa intre nivelele lui c-myc si HLA mRNA se observa numai dupa expunerea celulelor la rTNF-alpha (14).

Protooncogena c-myc amplificata si hiperexprimata este observata si in cancerele cervicale avansate, unde se asociaza cu progresia tumorii. Hiperexpresia c-myc este corelata cu un risc de 6 ori mai mare sugerand ca activitatea acesteia poate conferi celulelor tumorale, abilitate metastazica (15).

In 25% din histiocitoamele fibroase maligne se constata, de asemenea, 2-11 scurte amplificari ale genei c-myc, ca si cresterea activitatii ei transcriptionale (16).

Amplificarea genelor familiei myc in celulele canceroase pulmonare mici are loc in diferiti cromosomi. In 7 din 9 linii celulare genele c-myc, N-myc si L-myc apar amplificate, proces evidentiat in 60% din liniile celulare ale acestui carcinom. Amplificarea, indeosebi a genei c-myc se coreleaza cu cele mai agresive cancere, boala relevand cea mai dramatica evolutie (17).

 

 

Translocatia genei myc

Translocatiile cromosomiale presupun rearanjari specifice ale cromosomilor, care in cazul sistemului imunitar permit aparitia unei multitudini de proteine (anticorpi), ca raspuns la invazia antigenilor. Rearanjarile incorecte pot conduce la modificari moleculare cu tendinta de transformare celulara. Gena c-myc se presupune ca este implicata in transformare, in anumite translocatii care ii stimuleaza activitatea. Astfel sunt edificatoare translocatiile ei cu genele lanturilor greu si usor ale Ig in limfomul Burkitt si plasmocitomul murin. In celulele B maligne ale limfomului Burkitt, la 75% din pacienti s-a stabilit translocatia t (8;14), la aproximativ 16%, t (8;22), t (24;q11) si la 9%, t (2;8 ) (p11;q24).

Int (8;14), gena c-myc din cromosomul 8 (q8.4) este transferata in cromosomul 14,

locusul CH (al lantului greu VH Ig), iar gena IgCH trece in locul genei c-myc din cromosomul 8, mod in care apare t (8;14) (q24-q32). Gena c-myc astfel translocata este scoasa din circuitul reglator normal si intra sub influenta constitutiv activa a unui locus Ig; de aici sugestia ca ar juca un rol esential in transformarea maligna. Break point (punctul de rupere) din cromosomul 8 al genei c-myc este insa foarte diferit. Cand el are loc in exonul si intronul 1, gena este lipsita de elementele promotoriale proprii, considerandu-se astfel ca, transcrierea celor doi exoni ramasi, care au abilitate de transcriere, sunt sub noua influenta promotoriala, probabil elemente Ig. In unele cazuri, punctul de rupere din cromosomul 8 are loc la distanta de exonul 1, gena translocandu-se in intregime in cromosomul 14 laolalta cu exonul 1 detinator al structurii promotoriale proprii, ceea ce presupune ca cei doi exoni codificanti 2 si 3 sunt activati de propriile elemente activatoare. Cu toate acestea, gena c-myc juxstapusa Ig are expresie inalta datorata, probabil, plasarii ei sub influenta constitutiv activanta a unui locus Ig, fapt ce implica un rol esential in transformarea maligna. (18,19).

In majoritatea plasmocitoamelor murine, portiunea distala a cromosomului 15 ce poarta gena c-myc, este translocata in cromosomul 12 care poarta locusul lantului greu al unei Ig, sau in cromosomul 6 care poarta genele Ig kappa. In aceste conditii se pot produce mutatii in elementele reglatoare promotoriale ale genei sau, locusul Ig poate juca un rol mai activ cu

elementele reglatoare ce actioneaza asupra genei (20).

Imunocitomul spontan la sobolan Louvain (Ric) determina juxstapozitia lui myc cu

IgH, fiind de fapt, o translocatie reciproca t (6;7). Initierea transcriptionala a genei myc este schimbata la Ric. In linia stabilizata de fibroblaste Rat-2 de sobolan promotorul myc cel mai distal (P2) este locul preferat pentru initiere. In Ric insa, numai 30% din transcrieri sunt initiate in P2, 30 % in P1 si 30% intr-un nou promotor-P1a- localizat intre P1 si P2 (21).

Abilitatea celulelor normale de a modula transcrierea lui c-myc initiata in P2, ofera

un fin mecanism de control al nivelelor RNA c-myc. In modelele aberante exprimate de gena translocata c-myc in celulele limfomului Burkitt se produc mutatii in si langa alelele translocate. Elongarea transcrierii initiata in P2 poate fi blocata in conditiile in care se produc mutatii (22).

Expresia protooncogenei umane c-myc este supusa la numeroase nivele si tipuri de control. Proteina MDBP omniprezenta la mamifere, cupleaza specific intr-un loc de la inceputul primului intron al acestei gene. Proteina cupleaza la un enhancer viral, astfel ca poate fi utila pentru controlul expresiei genei c-myc.

In unele limfoame Burkitt, genele c-myc isi pierd locul de cuplare la MDBP prin rearanjare cromosomiala sau prin multiple mutatii spontane, ceea ce ar putea contribui la activarea lor in procesul cancerizarii (23).

Activarea constitutiva a lui myc este esentiala pentru geneza cancerului si de aceea intelegerea functiei sale depinde de identificarea si cunoasterea tintelor ei. Pentru determinarea mai specifica a rolului Myc in oncogeneza s-au facut o serie de studii in ideea identificarii genelor care sunt fie activate fie represate de catre Myc. S-au identificat astfel gene ce codifica molecule de suprafata cum este LFA-1 in linii celulare limfoblastoide de tip B, si unele gene care codifica histone exprimate normal in timpul diferentierii eritroide. C-Myc regleaza, de asemenea, gena pentru protimozina-alfa si gena ornitindecarboxilazei (ODC) prin intermediul elementului E-box din primul intron al acesteia tot prin interactiunea cu acesteia element E-box (29, 30).

Myc interactioneaza si cu o serie de componente ale ciclului celular cum sunt diversele cicline si kinazele asociate lor, precum si alti reglatori ai desfasurarii normale a ciclului celular. Astfel, s-a aratat ca proteinele myc actioneaza in amonte de o serie de kinaze dependente de ciclina, cum este cdc25, si antagonizeaza cu cel putin un inhibitor al acestora, proteina p27 (31). S-a demonstrat indirect o interactiune intre Myc si produsul genei Rb retinoblastoma si o corelatie intre expresia sa si cea a genei p53 (28). O cooperare intre Myc si Rb ar putea fi critica in timpul fazei G1 a ciclului celular dar si pentru reglarea intrarii in faza S.

Se admite ca oncogenele Myc stimuleaza celulele dorminde sa sintetizeze DNA, demonstrandu-se in acest sens ca hiperexpresia lui Myc in celule blocheaza diferentierea acestora. Stimularea cresterii celulare de catre c-myc poate fi responsabila de abilitatea acesteia de a initia si promota transformarea de tip malign (32).

Proteinele Myc sunt implicate nu numai in cresterea dar si in supravietuirea celulara. Astfel, se sustine ca dereglarea expresiei myc sensibilizeaza celulele la moartea prin apoptoza si ca proprietatile proapoptotice depind de capatul N-terminal si de domeniul bHL HL Zip al proteine, dar si de interactiunea cu proteinele partener. Unele gene ‘tinta’ ale proteinelor myc, cum sunt ODC si cdc25, se pare ca intervin in apoptoza mediata de myc (33).

Functiile genei myc

Productia genei c-myc induce activarea genelor care determina trecerea celulelor din

faza Go in faza G1 a ciclului celular. Experimente care au folosit transfectanti cu gena c-myc demonstreaza ca proteina c-Myc umana este predominant localizata in fractia nucleara, ceea ce induce sinteza a 8 proteine si represia sintezei a altor 5 proteine. De aici, concluzia ca expresia c-myc induce gene implicate in raspunsul proliferativ al celulei (24).

In celulele eucariote exista un schimb continuu de macromolecule, intre nucleoplasma si citoplasma, si de asemenea, o posibila cale de reglare a activitatii intracitoplasmatice a proteinelor nucleare carora le controleaza accesul in nucleu.

Studiul proteinelor nucleare c-Myc, c-Fos, polimeraza alpha DNA si PCNA (Antigen Nuclear care Prolifereaza Celula) in diverse conditii fiziologice ale celulei in repaus sau catre o stare proliferativa, releva ca raspunsul acestora este diferit. Cand fibroblastele sunt cultivate intr-un ser saracit proteinele sunt detectate in citoplasma in timp ce stimularea cu ser determina acumularea proteinelor in nucleu. Delocalizarea si relocalizarea celor patru proteine nu urmeaza insa aceeasi cinetica.

Proteinele replicarii PCNA si polimeraza alfa DNA sunt primele care parasesc nucleul dupa care urmeaza p c-myc si p c-fos in conditiile saracirii serului. Dimpotriva, in conditiile stimularii serului proteinele c-myc si c-fos sunt localizate rapid in nucleu si ulterior intra PCNA si alfa polimeraza DNA.

Comunicarea dintre compartimentul nucleu si cel citoplasmatic este mediata de complexul porilor nucleari, structuri proteinice care perforeaza nucleolema. Schimbarile in compozitia porului si/sau structura membranei nucleare apar in diferite stadii ale cresterii. Se conclude ca proteinele c-Myc si c-Fos sunt implicate in evenimentele reglatoare pe cand celelalte doua proteine, PCNA si alfa polimeraza DNA sunt implicate in mecanismul replicarii DNA.

Cultura de celule de Xenopus a aratat variatii semnificative in localizarea lui c-myc si PCNA in timpul dezvoltarii. Astfel proteina c-Myc este pusa in rezerva in mari cantitati in citoplasma oocitului si translocata in nucleu dupa fertilizare, in timp ce localizarea nucleara a PCNA apare ciclic in etapele dezvoltarii timpurii la Xenopus. Asa incat la inceputul ciclului celular, in faza G1, se produce o acumulare intranucleara a proteinelor c-Myc si c-Fos, in timp ce PCNA si alfa DNA polimeraza se acumuleaza perinuclear. Totusi PCNA se detecteaza in nucleu numai in timpul fazei S si niciodata la periferia acestuia (25).

Protooncogena c-myc din oviductul avian poate fi influentata de actinea progesteronului. Cantitatea de mRNA specific c-myc a scazut dupa 10 minute de la injectarea hormonului. Dupa 30 de minute acest indicator a atins minimum (30% din valoarea primara), dupa care are loc oprirea treptata a sintezei mRNA c-myc. Efectul observat depinde de doza hormonului si este tesut-specifica. Se presupune ca gena de reglare timpurie, in particular c-myc, reprezinta punctul incipient al activitatii receptorilor hormonilor steroizi (26).

In absenta diviziunii celulare c-myc are rolul in controlul cresterii celulare. Reglarea proliferarii implica coordonarea cresterii celulelor (acumulare de masa celulara) si a dezvoltarii celulelor. Celulele P493-6 au aratat ca diviziunea lor este strict dependenta de prezenta serului fetal de vitel. Myc singura induce cresterea in dimensiuni a celulelor si regleza pozitiv sinteza proteinei. O crestere a sintezei proteinei ar putea fi o cauza a cresterii masei celulare. Myc stimuleaza activitatea metabolica, asa cum indica si acidifierea mediului de cultura. Se confirma modelul precum ca myc este implicat in reglarea cresterii celulei si confera pentru prima data evidenta indirecta ca induce cresterea celulei, o crestere in

dimensiune a celulei, necuplata la diviziunea celulara (27).

Protooncogena myc regleaza direct expresia altor gene prin cuplarea secventelor

DNA specifice CACGTG. Printre genele tinta se citeaza ECA-39, p53, ODC (ornitin decarboxilaza), alfa-protimozin, cdc25A pentru reglarea lor de catre myc mai sunt necesari si alti factori celulari specifici (28).

 

 

N-myc

Gena N-myc si proteina N-myc prezinta numeroase similaritati cu gena c-myc si proteina c-myc. Pentru prima data, gena N-myc s-a descoperit in neuroblastoma de unde de altfel vine si initiala N. S-a demonstrat contributia ei la transformarea neoplazica a celulelor mamaliene in cultura. Gena N-myc atat din celulele normale cat si din celulele de

neuroblastoma este de 16 kb iar mRNA de 4 kb.

Amplificarea genei, uneori de proportii, o incrimineaza in carcinogeneza (stadiile III

si IV ale neoroblastomului) (34).

Asa cum s-a mentionat, gena N-myc este localizata pe bratul scurt al cromosomului 2

(2p23-24) iar secventele ei amplificate, pe alti cromosomi.

Inhibarea expresiei N-myc prin metoda antisens conduce la aparitia de fenotipuri

diferite: intermediar, neuronal sau de tip Shwann, si induce fie supresia proliferarii celulare fie diferentierea si/sau apoptoza. Aceste constatari sugereaza ca N-myc poate actiona in procese celulare diferite (35).

Expresia N-myc este asociata in mod normal cu statutul nediferentiat al neuroblastelor care migreaza in timpul embriogenezei din creasta neurala (36) fiind implicata in reglarea directiei de dezvoltatre si evolutiei celulelor acesteia, respectiv in migrarea ventrala si diferentierea neuronala (37). Astfel, N-myc este reglata negativ in urma inducerii diferentierii celulelor de neuroblastom de catre acidul retinoic (RA) sau IFN-gamma; acesta din urma scade transcriptia lui N-myc si reduce ‘half-life’ al mRNA (36).

In alte tipuri de celule decat cele de origine neurala, expresia N-myc este, de asemenea, importanti pentru dezvoltare. Soarecii mutanti pentru gena N-myc arati o dezvoltare anormala a ficatului, expresia acestei gene fiind limitata la nivelul structurilor periferice ale ficatului care vor genera capsula Glisson si este necesara pentru supravietuirea hepatocitelor (38).

Amplificarea genei N-myc este un fenomen frecvent intr-o serie de celule tumorale in care ea se exprima, fiind asociata cu progresia rapida si prognosticul sumbru in neuroblastom (39) expresia sa core-landu-se cu aparitia si evolutia metastazelor (36). Nu numai N-myc, dar si celelalte doua gene myc pot dobandi un control transcriptional aberant in neuroblastom ( 0 ) .

4 N-myc s-a gasit a fi amplificata in 30 de linii celulare de cancer pulmonar si doar intr-o singura linie de adenocarcinom, situatie de altfel foarte rara (41). Detectarea prin FISH (Fluorescence In Situ Hybrdization) a amplificarii N-myc in celulele alveolare sau embrionare de rabdomiosarcom releva ca tumora apare doar in celulele alveolare nu si in cele embrionare, amplificarea genei putand constitui un factor de prognostioc in cazul evolutiei nefavorabile a bolii (42). Tot ca factor de prognostic poate fi utilizata amplificarea lui N-myc in cazurile de gliom primar sau secundar (43).

Expresia si functia N-myc este, la randul sau influentata de diversi factori, existand o corelatie intre expresia sa si a altor tipuri de proteine implicate in proliferare, diferentiere sau

transformare si, de asemenea, influentata si de catre factori extracelulari. In acest sens, s-a constatat o corelatie intre expresia genei N-myc si o gena supresoare tumorala Wt1 (identificata in tumora Wilms’ a rinichiului la copii) in sensul ca ele sunt coexprimate in mod normal in timpul dezvoltarii rinichiului si sunt hiperexprimate in tumora Wilms. S-a aratat de asemenea ca represia promotorului genei N-myc este mediata de gena Wt1 (44).

Dintre factorii extracelulari, IGF-1 (Insuline-like Growth Factor - 1) stimuleaza cresterea nivelului mRNA al N-myc peste limitele bazale in linii celulare de neuroblastom, stimulare mediata de o cascada de semnalizare in care sunt implicate protein kinaze activate de mitogeni (45).

 

L-myc

Gena umana L-myc codifica multiple fosfoproteine nucleare ca urmare a procesarii alternative a mRNA. In liniile celulare de carcinom pulmonar cu celule mici se formeaza cateva proteine de fosforilare de 66 kD si de 60 kD, care se constituie prin translocarea mRNA L-myc. Acestea se localizeaza in nucleu si au o viata foarte scurta.

Asemenea genei c-myc, L-myc detine 3 exoni si 2 introni, un mRNA L-myc din care

se scoate al doilea intron va fi de 3,9 mii nucleotide, iar daca se elimina primul intron, mRNA devine de 3,6 mii nucleotide si va elabora proteina de 60 kD. In vivo, acest RNA sintetizeaza proteinele p32 si p37, care sunt prezente si in vitro procesarea diferita a transcriptului genei L-myc poate determina corelatia p60, p66 (46, 47).

L-myc a fost initial identificata in carcinomul pulmonar, fiind frecvent amplificata si hiperexprimata in cel cu celule mici si este slab exprimata in tesuturi umane adulte. In alte tipuri de carcinom pulmonar, altele decat cele cu celule mici, L-myc este hiperexprimata dar nu si amplificata (48). Prin inhibarea L-myc intr-o linie celulara de carcinom pulmonar cu celule mici care hiperexprima L-myc, s-a obtinut inhibarea proliferaii celulare (49).

In mod normal, L-myc, ca si ceilalti doi membri ai familiei Myc este implicata in procesele biologice de crestere si diferentiere. In dezvoltarea normala la soarece, gena L-myc este exprimata in rinichi, plamani, tub neural si creier, in cel din urma fiind prezenta atat in zonele proliferative cat si in cele diferentiate. Faptul ca soarecii nuli pentru L-myc se dezvolta normal si sunt viabili sustin ideea conform careia functiile sale ar putea fi preluate de catre celelalte proteine Myc si ca exista mecanisme functional compensatorii in cadrul acestei familii de proteine (50).

Myc/Max/Mad

Un pas deosebit de important in intelegerea functiei Myc a fost identificarea unei

familii de proteine, de 21-22 kDa, si anume proteinele Max, care fac parte ca si Myc din grupul proteinelor ce contin motivele bHLHZip (basic region Helix-Loop-Helix Leucine Zipper) (51). Functia biologica a lui Myc nu poate fi exercitata decat in urma heterodimerizarii cu proteinele Max. Interactiunea Myc-Max se face prin intermediul motivelor “helix-loop-helix” si “leucine-zipper” din structura acestora. Heterodimerii Myc-Max leaga DNA cu afinitate ridicata si sunt foarte buni transactivatori transcriptionali. Homodimerii Myc-Myc au afinitate redusa de legare a DNA iar homodimerii Max-Max sunt inactivi deoarece nu contin domeniul activator care se gaseste la capatul N-terminal al lui Myc.

Complexul Myc-Max leaga DNA la nivelul secventei 5’-CACGTG, cunoscuta si ca miezul „Myc” din elementul E-box. Acest element contine secvente repetitive purina/pirimidina care se pot modifica conformational de la structura B-DNA la structura Z-DNA. E-box este frecvent intalnit in genomul uman si poate fi legat si de catre alte proteine in aceeasi maniera ca si complexele Myc/Max. De aceea, s-au derulat o serie de studii in celulele COS-7 (52) si in creier murin (53) menite sa determine specificitatea cu care transcriptia este mediata de acest element.

Max interactioneaza cu toate proteinele myc (c-Myc, N-Myc si L-myc) in reglarea transcriptiei dar poate functiona ea insasi si ca represor transcriptional (54, 55).

Localizarea genei Max a fost cartata pe cromozomul 14; deletiile care implica acest cromosom in malignitati mieloide sau limfoide precum si translocatiile acestuia in leiomiomul uterin explica dereglarea functiei proteinei in aceste tipuri tumorale (56).

Proteinele Max exista ca doua izoforme care difera prin insertia/deletia a 9 reziduuri

de aminoacizi. Acestea sunt Max(L) sau forma lunga si Max(S) sau forma scurta. Max(L) este mai eficienta in legarea DNA decat Max(S). S-a aratat in culturi de celule NIH3T3 ca forma Max(L) represeaza o gena reporter myc-responsiva in timp ce Max(S) fie stimuleaza fie nu are efect asupra acesteia. Comparativ cu celulele care hiperexprima Max(S), cele care hiperexprima Max(L) cresc mai lent, au necesitati ridicate pentru factori de crestere si au o apoptoza mai accelerata in momentul deprivarii de factori de crestere (57).

Expresia proteinelor Max in celulele epiteliale imortalizate sau transformate, precum si in fibroblaste este reglata in functie de conditiile de crestere (58). In procesul diferentierii celulare, in celulele K562 expresia Max ramane neschimbata in timpul diferentierii catre linia mielomonocitara, pe cand in cazul diferentierii eritroide expresia sa este reglata negativ (59).

Linia celulara tumorala de feocromocitom, PC12, nu exprima o proteina Max functionala deoarece in aceste celule se sintetizeaza un transcript mutant care codifica o proteina incapabila sa homo- sau heterodimerizeze (33).

Pierderea functiei proteinei Max la soareci rezulta in intarzieri in dezvoltare si chiar in blocarea cresterii embrionilor si tesuturilor extraembrionare, ceea ce coincide cu pierderea sau reducerea expresiei Max maternal in embrionul in crestere

in vivo. Embrionii cu deficienta in expresia max sunt redusi ca dimensiune si prezinta degenerari citologice precum si capacitate redusa de incorporare a BrdU (60).

In ceea ce priveste interactiunile directe sau/si functionale intre Myc si Max, exista si evidente conform carora ele pot actiona si independent in diverse tipuri celulare sau conditii experimentale. Astfel, in celulele K562, in timp ce mutanti cu deletii ai proteinei Myc induc diferentierea catre linia eritroida, hiperexpresia lui Max stimuleaza acelasi tip de diferentiere (61). In hepatocitele dorminde sau stimulate cu mitogen, Myc si Max pot actiona atat independent cat si in cadrul complexului Myc/Max (62). In celule mieloide murine, linia 32D, Myc si Max intervin in cai apoptotice diferite (63). Interesant este faptul ca in animale bitransgenice pentru Myc si Max directionate de Emu (pentru lantul greu de Ig), hiperexpresia lui Max atenueaza statutul premalign de tip B-limfoproliferativ indus de Emu-Myc si reduce rata instalarii bolii; aceasta sugereaza ca ridicarea nivelului expresiei proteinei Max in vivo poate inhiba functia oncogenica a lui Myc (64).

-Noua familie de proteine, recent descoperita, si anume familia Mad care cuprinde Mad1, Mxi-1, Mad3 si Mad4, antagonizeaza cu functia Myc prin cuplarea Max si formarea de heterodimeri Max-Mad care blocheaza procesul transcriptional prin legarea la acelasi situs pe DNA ca si heterodimerul Myc-Max (65). Max este considerat un partener central al lui Myc

cu capacitate alternativa de reglare, putand avea efecte opuse la legarea aceleiasi secvente de DNA. Heterodimerii Myc-Max functioneaza ca activatori transcriptionali in timp ce heterodimerii Max-Mad functioneaza ca supresori transcriptionali.

Foarte recent s-a identificat o noua proteina - Mmip-2- din familia “RING finger”,

care poate cupla proteinele Mad si astfel poate disrupe legarea la DNA a heterodimerului Max/Mad, putand astfel anula efectul supresiv al proteinelor Mad asupra proteinelor Myc. Mad si Mmip-2 se gasesc in diferite compartimente citoplasmatice si nucleare, ceea ce s-a demonstrat prin trasarea lor cu GFP (Green Fluorescent Protein); ele interactioneaza si se transloca in compartimentul celular in care se afla mai abundenta (66).

-Alta proteina care interactioneaza cu proteinele familiei Mad este proteina bHLHZip Mlx (Max-like protein x) care structutal si prin gradul extins de expresie in variate tipuri tisulare se aseamana cu proteina Max; are un timp de injumatatire prelungit si prin faptul ca formeaza heterodimeri cu proteinele Mad este capabila sa lege secventa CACGTG din structura DNA (67). Expresia lui Mad in tesuturi de soarece adult este limitata doar la acele tesuturi care contin populatii celulare al caror proces de diferentiere se reinnoeste in mod constant. In embrioni, transcriptele lui Mad sunt maxime in timpul organogenezei in momentul inceperii diferentierii celulare. Transcriptele membrilor familiei Mad sunt exprimate diferit in timpul diferentierii celulelor in condrocite in vivo si in neuroni (celulele P19) in vitro. Astfel, transcriptul si proteina Mad3 au fost identificate in celulele proliferante, priori diferentierii. Mlx si Mad4 sunt mai abundente in celulele avansate in procesul diferentierii, iar Mad1 a fost identificata in celulele diferentiate terminal (68).

Alterarea functiei lui Mad inhiba iesirea granulocitelor din ciclul celular in timpul diferentierii acestora. La soareci, disruperea expresiei genei mad1 in urma recombinarii de tip omolog, releva ca precursori granulocitari sunt blocati in stadiul de “colony forming” (precursori formatori de colonii), in urma diferentierii hematopoietice in mutantii homozigoti. La soarecii nuli pentru Mad1 insa, numarul celulelor diferentiate din maduva osoasa si sangele periferic nu se schimba (69). Acelasi studiu arata ca reconstituirea seriei granulocitare dupa ablatia maduvei este crescuta la soarecii “knockout” pentru Mad1. In schimb, la aceste animale s-a constatat ca sunt exprimate ectopic in splina, alte doua gene ale familiei Mad, ceea ce sugereaza o redundanta functionala si o reglare care permit diferentierea aparent normala in absenta lui Mad 1 in cadrul acestei familii de gene.

Deletia la soareci a genelor Mad1 si Mxi-1 din familia Mad arata ca, desi ele induc aparitia unor diferite fenotipuri, ambele gene sunt esentiale in procesul de iesire din ciclul celular si al diferentierii celulare si, de asemenea ca, cel putin Mxi-1 poate actiona ca supresor tumoral (70).

Se admite existenta unei asa-numite “retele” Myc/Max/Mad, esentiala pentru reglarea expresiei genice. Masurarea afinitatilor la DNA a complexelor c-Myc/Max, Max/Max si Mad1/Max in celulele COS7 a demonstart ca toate acestea leaga DNA cu afinitate comparabila la nivelul secventei E-Box specifica pentru c-myc. In celulele HL-60 nu s-a detectat complexul Mad1/Max desi s-a indus expresia Mad1 in timpul diferentierii lor. Complexul c-Myc/Max din aceste celule este reglat negativ, in timp ce reglarea complexului Max/Max a crescut (71). Aceste constatari au condus autorii la concluzia ca, in cadrul retelei Myc/Max/Mad are loc o reglare posttranscriptionala. Complexul Max/Mad nu are doar capacitatea de a inhiba transcriptia, dar s-a demonstrat si faptul ca poate bloca transformarea co-indusa de Myc-Ras (67).

Trecerea de la Myc-Max la Max-Max cupleaza arestul celulelor in ciclul celular, cu diferentierea celulara. Astfel, expresia ectopica a lui Mad1 la soareci transgenici, conduce pe

de o parte la letalitate postnatala si piticism, si pe de lata parte, are efect inhibitor asupra proliferarii celulelor hematopoietice si fibroblastelor embrionare provenite de la aceste animale. Fibroblastele care exprima Mad1 ectopic au morfologie alterata si comparativ cu cele de tip-salbatic sunt intarziate in progresia ciclului celular la trecerea din faza G1 in fazaS (65).

 

 

C-myc, N-myc si L-myc

Membrii familiei genelor myc, c-myc, L-myc si N-myc, desi codifica proteine cu structura si functii in general asemanatoare, acestea sunt exprimate diferential in diversele tipuri celulare, ceea ce sugereaza pe langa functiile biologice comune ale acestor proteine si unele functii distincte. Reglarea acestor trei gene difera de la tesut la tesut, iar aceste diferente rezida in capacitatea fiecareia dintre ele de a se lega la DNA, un control suplimentar in acest sens fiind cuplarea proteinlor partenere Max (72).

Studiul creierului uman fetal in timpul dezvoltarii a relevat prezenta c-myc, N-myc si

L-myc in celule postmitotice din straturile corticale si intermediare dar si in straturile active mitotic care contin celule neuroepiteliale precursoare (73).

In timpul dezvoltarii la soareci, desi L-myc se exprima in rinichi, plaman dar si in zonele proliferative si diferentiate ale creierului si tubului neural, soarecii nuli pentru L-myc sunt viabili, competenti reproductibil si nu au anomalii congenitale (51).

In astrocitele de soarece stimulate in vitro cu INF-gamma expresia c-myc si L-myc creste mult peste nivelul bazal. In schimb, astrocitele diferentiate terminal nu exprima deloc N-myc iar tratamentul cu INF-gamma nu induce expresia acestuia (74).

In cadrul aceluiasi tip celular proteinele Myc actioneaza diferential fiind implicate in procese fiziologice diferite. De exemplu, in celulele cristalinului de soarece, L-myc este implicata in procesul diferentierii celulelor epiteliale in celule fibroase, in timp ce c-myc nu afecteaza diferentierea si favorizeaza proliferarea (75).

N-myc si L-myc sunt exprimate cu deosebire in creier in timpul dezvoltarii. Precursorii neurali care s-au angajat catre o anumita directie de diferentiere exprima ambele proteine pe cand celulele deja angajate exprima doar una dintre ele. Astfel, N-myc este hiperexpresata intr-o linie celulara de precursori