t9z21zl

Conventional, antigenele se definesc ca substante straine, care, consecutiv introducerii in organismul uman sau animal pe o cale parenterala (alta decat cea digestiva), declanseaza sinteza anticorpilor cu care se combina specific. Definitia este incompleta din cateva motive.
1. Calea digestiva de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilitatea declansarii raspunsului imun. Pentru agentii infectiosi care se multiplica in tractul digestiv, administrarea orala asigura o buna imunizare (de exemplu, vaccinul polio se administreaza oral, desi calea parenterala este mai eficienta).
2. Unele substante nonself sunt in mod eronat considerate ca neantigenice, deoarece, desi in vivo stimuleaza reactivitatea imunitara si induc sinteza unei cantitati mici de anticorpi, in vitro nu produc reactii vizibile antigen-anticorp.
3. Fata de unele antigene, organismele nu declanseaza raspunsul imun, ci manifesta o stare de toleranta.
4. Unele molecule in stare nativa nu induc un raspuns imun, ci numai dupa cuplarea covalenta cu o molecula purtator. Molecula nativa isi pastreaza proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizati. Astfel de molecule se numesc haptene.
J. F. Bach (1976) defineste antigenele ca fiind molecule care, consecutiv introducerii in organism pe o cale adecvata, induc un raspuns imun materializat prin proliferarea celulelor limfoide si sinteza moleculelor de recunoastere (anticorpi si receptori celulari), cu care se combina in vivo si in vitro.
Modelul general de structura a unui antigen
O molecula antigenica este alcatuita din doua componente; -componenta purtator ("carrier"), care corespunde celei mai mari parti a moleculei: gruparile determinante de specificitate sau epitopi, localizate pe suprafata componentei purtator si formate din secvente specifice de monomeri. Epitopii, prin secventa proprie a monomerilor si prin configuratia spatiala specifica, confera individualitate chimica si specificitate antigenica moleculei nonself. Gruparile determinante de specificitate sunt echivalentii moleculari si functionali ai haptenei.

Gruparile determinante de specificitate se gasesc in numar variabil pe suprafata purtatorului si pot fi identice atat in ceea ce priveste compozitia chimica, cat si configuratia spatiala (ca in cazul antigenelor polizaharidice cu epitopi repetitivi) sau sunt diferite, atat ca secventa a monomerilor cat si in privinta configuratiei spatiale.
Proprietatile definitorii ale antigenelor
in studiile experimentale asupra imunogenitatii unor molecule sintetice, M. Sela (1969) a descris doua proprietati esentiale ale antigenelor:
1. Imunogenitatea sau antigenitatea este proprietatea unui antigen complet, format din gruparea carrier si epitopi, de a declansa un raspuns imun, humoral sau celular, ori de cate ori patrunde in organism pe o cale adecvata. Proprietatea de imunogenitate este asociata cu gruparea carrier a moleculei de antigen, grupare care intr-o oarecaremasura influenteaza si specificitatea anticorpilor.
2. Specificitatea defineste capacitatea antigenului intreg sau numai a epitopilor sai de a se combina specific cu anticorpii sau cu receptorii celulari a caror sinteza a fost indusa. Proprietatea de specificitate este dependenta, in primul rand de epitopi, dar este influentata intr-o masura mai mare sau mai mica si de gruparea carrier.
Notiunea de imunogen, uneori, este distincta de aceea de antigen. Notiunea de imunogen este mai restrictiva si semnifica proprietatea unei substante, in stare nativa, de a stimula raspunsul imun, fara sa necesite conjugarea cu o alta molecula.
Notiunea de antigen este mai larga, deoarece desemneaza molecule nonself care sunt imunogene in stare nativa sau devin imunogene dupa conjugarea cu o molecula purtator. Antigenul poate fi uneori inacapabil, in forma sa nativa, sa stimuleze raspunsul imun.
Clasificarea si imunogenitatea antigenelor
Dupa originea lor, antigenele sunt exogene si endogene. Antigenele exogene sunt cele mai numeroase si pot fi impartite in trei categorii: 1) naturale; 2) artificiale; 3) sintetice.
Antigene naturale
Antigenele naturale formeaza categoria cea mai cuprinzatoare. Aici sunt incluse toate macromoleculele naturale din virusuri, microorganisme, fungi, plante si animale.
Dupa dimensiuni se disting antigene moleculare ("solubile") si antigene corpusculare.
Antigenele moleculare (solubile) constituie gruparea cea mai numeroasa, care include toate tipurile de macromolecule: proteine, polizaharide, lipide, acizi nucleici.
Antigenele corpusculare ("insolubile") sunt reprezentate de virusuri si de celule (procariote si eucariote).
Antigenele moleculare
Cele mai studiate antigene sunt proteinele si polizaharidele, la care se adauga conjugatele: glicoproteine, nucleoproteine, lipoproteine, peptidoglicani, glicolipide.
Proteinele sunt cele mai numeroase si mai importante antigene moleculare. Diversitatea lor chimica, generata de variatia secventei de aminoacizi este uriasa. Practic, fiecare tip de molecula proteica nonself din lumea vie este un antigen pentru organismul animal si uman, deoarece are o secventa unica de aminoacizi, care determina o structura secundara si tridimensionala proprie si implicit, existenta unor epitopi proprii ca secventa a aminoacizilor si conformatie spatiala.
Imunogenitatea este o proprietate generala a proteinelor, a celor cu rol structural (colagenul, cheratina, elastina, fibroina viermelui de matase, proteinele capsidei virale), a celor cu rol functional (miozina, actina, albumina, hemoglobina, mioglobina, enzime, hormoni, imunoglobuline), a celor cu rol de depozit de aminoacizi(ovalbumina, cazeina, gliadina - din semintele de grau). Toate proteinele si polipeptidele cu o greutate moleculara mai mare de 1000 D sunt imunogene, intr-o masura mai mare sau mai mica.
De cele mai multe ori, pentru antigenele proteice, nu se face distinctia dintre epitopii inductori ai raspunsului imun si gruparea carrier, deoarece proteinele poseda un spectru continuum de determinanti antigenici, ce corespund unor secvente discrete ale suprafetei moleculare localizate in zonele cele mai expuse contactului cu receptorii sistemului imunitar. Antigenitatea moleculelor globulare este determinata adeseori, de configuratia lor spatiala, rezultata din plierea tridimensionala. Pentru cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina, lizozimul, ribonucleaza etc), aproape toti determinantii antigenici sunt conformationali, adica sunt rezultatul plierii spatiale a moleculei, iar altii sunt secventiali, adica sunt reprezentati de o secventa particulara de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare (cheratina, colagenul, fibroina) au configuratii mai simple decat cele globulare, catenele lor fiind aranjate sau rasucite pe o singura dimensiune. Determinantii antigenici ai acestor proteine sunt secventiali, formati din 3-6 aminoacizi.
Sistemul imunitar al unui organism recunoaste un numar limitat de determinanti antigenici ai unei molecule proteice. Epitopii, conformationali sau secventiali, care stimuleaza raspunsul imun in vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc epitopi dominanti. O parte a determinantilor antigenici ai unei molecule native, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilentiosi), nefiind accesibili sistemului imunitar al organismului, dar se pot exprima intr-un anumit set de conditii de imunizare (gazda, adjuvant etc). Acestia sunt epitopi interni ai proteinelor globulare. Un determinant intern poate fi silentios in molecula nativa, dar devine imunostimulator dupa clivarea enzimatica a moleculei, in vivo sau in vitro. De aceea, M. Sela a recomandat utilizarea termenului de "grupare imunodominanta", pentru epitopul sau epitopii care se exprima in anumite conditii(gazda, adjuvant, cale de administrare) si determina specificitatea raspunsului imun.
Imunogenitatea antigenelor proteice se modifica in diferite conditii.
Denaturarea moleculelor native sub actiunea agentilor chimici si a caldurii, modificarea configuratiei moleculei sub actiunea agentilor reducatori sau hidroliza enzimatica, modifica imunogenitatea. Anticorpii specifici fata de proteina nativa precipita slab sau de loc proteina denaturata termic sau chimic.
Formaldehida si glutaraldehida sunt agenti de legare incrucisata a moleculelor proteice, constituind retele multimoleculare stabile. Acesti agenti produc denaturarea proteinelor si modifica functiile celor cu activitate biologica (toxine, enzime). Astfel, exotoxinele tratate cu formaldehida, isi pierd proprietatile toxice, dar raman imunogene. Formaldehida si glutaraldehida se folosesc pentru conservarea antigenelor cu greutate moleculara mica (peptide), dar sunt mai putin utilizate pentru conservarea proprietatilor antigenice ale moleculelor mari. Agentii chimici de legare incrucisata modifica imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformatiei moleculei si mascarea epitopilor sau prin modificarea chimica a aminoacizilor epitopului.
Denaturarea semnifica deplierea structurii rasucite a moleculelor proteice si are loc prin modificarea pH, prin incalzire, prin reducerea legaturilor S-S sub actiunea ureii si a beta-mercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare, proteina isi pierde nu numai functia biologica, dar isi modifica specificitatea antigenica. De exemplu, cele 4 punti S-S ale RN-azei, intre resturile de cistina, sunt reduse de p-mercaptoetanol si transformate in 8 resturi de cisteina, cu pierderea totala a activitatii enzimatice. Anticorpii fata de RN-aza pancreatica bovina nativa nu precipita moleculele de RN-aza denaturata prin reducerea legaturilor S-S. Invers, anticorpii fata de RN-aza denaturata, nu precipita RN-aza nativa. Modificarea specificitatii anticorpilor sugereaza ca reducerea legaturilor S-S determina pierderea epitopilor conformationali.
Proteinele denaturate reverseaza greu la forma nativa, chiar prin restabilirea conditiilor de mediu.
Hidroliza enzimatica modifica configuratia spatiala a moleculelor proteice native si diminua imunogenitatea lor, cu atat mai mult cu cat fragmentele rezultate au dimensiuni mai mici. Prin clivare enzimatica se anuleaza imunogenitatea epitopilor conformationali si se releva epitopi care in molecula nativa au statutul de epitopi criptici.
O atentie speciala s-a acordat studiului imunogenitatii unor proteine ale caror proprietati biologic-active sunt usor de evaluat: enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine, imunoglobuline (in calitatea lor de antigene), proteine ale capsidei sau ale invelisului viral.
Enzimele sunt antigenice, indiferent de originea lor. Reactia moleculelor de enzima cu anticorpii specifici a constituit o modalitate de determinare a pozitiei epitopilor. Anticorpii fata de diferiti epitopi ai moleculei de enzima modifica in grade foarte diferite activitatea ei catalitica. Daca anticorpii sunt specifici fata de epitopi localizati la nivelul situsului activ al enzimei, molecula isi pierde activitatea fata de substrat, deoarece legarea anticorpilor la situsul activ inhiba competitiv legarea moleculelor de substrat. Gradul de inhibitie a activitatii enzimatice este cu atat mai accentuat, cu cat molecula este mai mare. Efectul inhibitor al anticorpilor nu se produce daca enzima a legat deja substratul specific. Daca gruparile determinante de specificitate ale moleculei de enzima sunt situate in afara situsului catalitic, activitatea enzimei este partial inhibata, datorita modificarilor conformationale care survin dupa reactia antigen-anticorp, sau ramane intacta. Foarte rar, complexul enzima-anticorp are un efect catalitic superior, comparativ cu enzima nativa.
Hormonii sunt molecule slab imunogene, datorita uniformitatii relative a structurii lor chimice in regnul animal. Anticorpii specifici fata de majoritatea hormonilor proteici se obtin prin asocierea lor prealabila cu adjuvantul Freund. Imunogenitatea hormonilor este intr-o relatie directa cu gradul deosebirilor chimice existente intre hormonul exogen si hormonul produs de organismul receptor. Consecinta este sinteza anticorpilor antihormon.
Proprietatile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute, datorita utilizarii clinice a hormonului. Molecula de insulina este alcatuita din doua catene polipeptidice, cu un numar total de 51 de aminoacizi: 21 ai catenei A si 30 ai catenei B. Cele doua catene sunt reunite prin punti S-S. Structura moleculelor de insulina de la diferite specii este foarte asemanatoare, 47 din cei 51 de aminoacizi fiind identici. Deosebirile se gasesc in catena A pentru aminoacizii 8, 9 si 10 (la bovine Ala, Ser, Val, la om sunt Thr, Ser, Ne, iar la ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferenta este limitata la aminoacidul
C-terminal. Aceste mici diferente ale secventei de aminoacizi nu modifica functia hormonului. De aceea, insulina, indiferent de provenienta, este la fel de eficienta pentru tratamentul diabetului uman. Micile diferente de secventa, in general, nu sunt sesizate de organismul receptor. Totusi, dupa administrare prelungita, organismele receptoare cu reactivitate imunitara mai inalta, sintetizeaza anticorpi anti-insulina.
Polizahandele, desi au complexitate structurala relativ mare, conditionata de multitudinea posibilitatilor de legare a atomilor de carbon, sunt molecule slab imunogene in stare nativa, comparativ cu proteinele. Antigenitatea lor este conferita de succesiunea unitatilor componente, de configuratia spatiala a moleculei si de greutatea moleculara. Cele cu greutati mai mici de 50 kD nu sunt imunogene. Polizahandele sunt antigene cu epitopi secventiali repetitivi si cel putin uneori, in functie de originea polizaharidului si de specia imunizata, sunt imunogeni.
Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting doua tipuri de polizaharide: a) cele care au o catena centrala pe care se insera ramificatiile laterale; b) polizaharide lipsite de o catena centrala, iar ramificatiile sunt dispuse aleatoriu, fara nici o simetrie. Rolul catenelor centrale in conferirea imunogenitatii este controversat, dar ramificatiile laterale au o importanta deosebita pentru determinarea specificitatii antigenice a polizaharidelor. Din punctul de vedere al compozitiei chimice pot fi homo- sau heteroplizaharide, iar in ceea ce priveste sarcina, pot fi neutre sau incarcate. Oligo- si polizaharidele pot dobandi o structura tertiara (globulara). Uneori, configuratia spatiala a polimerului glucidic este determinanta pentru specificitatea sa antigenica. Schimbarile conformationale ale polizaharidelor se produc mai usor decat ale proteinelor, pentru ca au bariere energetice scazute. Pentru polizaharide, denaturarea este practic necunoscuta, ceea ce le confera stabilitate. Daca imunogenitatea polizaharidelor native este slaba, adeseori ele se comporta ca haptene, adica devin antigenice dupa cuplarea cu un purtator proteic, rezultand lectine, cu o foarte larga distributie in lumea vie. In calitate de haptene, polizaharidele au proprietatea de specificitate, adica se combina cu anticorpii complementari fata de complexul glicoproteic.
Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacteriana: dextranul si polizaharidele capsulare.
Dextranii sunt polimeri ramificati de glucoza, resturile glucozil fiind unite mai ales prin legaturi de tip a 1-6, dar in functie de specia producatoare, punctele de ramificatie ale catenelor polimere pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4.
Dextranii sunt sintetizati in special de unele bacterii lactice, din zaharoza, dupa reactia:
Dextranaza N(zaharoza) ............... (Glucoza)n + (Fructoza)n
Dextranii au greutati moleculare foarte diferite (pana la 10 6 D), in functie de gradul de polimerizare. Nu sunt imunogeni si de aceea se folosesc ca inlocuitori ai plasmei. Prin transfuzii repetate cu solutii de dextran la om si prin injectare repetata la soarece, s-au sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor antidextran este foarte inalta. In serul animalelor imunizate cu dextrani s-au detectat doua tipuri de anticorpi: unii specifici fata de resturile de glucozil legate 1-2 si altii specifici fata de resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reactii incrucisate, desi deosebirea dintre cele doua categorii de molecule de dextran consta numai in modul diferit de legare a resturilor de glucozil intre ele.
Polizaharidele capsulare se pot gasi fie sub forma moleculelor libere ("solubile"), fie sub forma corpusculara (atasate celulelor bacteriene capsulate).
Variatiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate de compozitia glucidica a catenei, de secventa monomerilor sau de modul de legare a lor in catena, confera tulpinilor bacteriene, specificitate antigenica de tip. La Str. pneumoniae s-au identificat peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In compozitia lor intra hexoze, pentoze, derivatii lor aminati, metilati etc. Specificitatea antigenica a polizaharidelor capsulare depinde atat de compozitia chimica, cat si de succesiunea monomerilor in catena polizaharidica. Ca vaccinuri, polizaharidele induc starea de toleranta.
Acizii nucleici in stare purificata sunt molecule neimunogene, datorita uniformitatii lor structurale in lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce sinteza anticorpilor. Acizii nucleici nativi sunt conjugate nucleoproteice, in care acizii nucleici au rolul de haptena. Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformationali. O fractie din anticorpii anti-conjugat se combina cu acizii nucleici. Anticorpii anti-acizi nucleici se combina cu acizii nucleici in stare pura, indiferent de provenienta. Proteinele asociate acizilor nucleici confera o noua specificitate antigenica si determina sinteza anticorpilor care se combina cu proteina putator.
Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obtin pe una din urmatoarele cai:
1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T2, T4, Tq), supusi socului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebeste de ADN din celulele eucariote, prin prezenta 5-hidroxi-metilcitozinei glicozilate, in locul citozinei. Anticorpii au specificitate fata de bazele glicozilate, ceea ce explica lipsa reactiilor incrucisate cu alti acizi nucleici.
2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale. Anticorpii sintetizati reactioneaza cu ARN de origine bacteriana, vegetala sau animala, precum si cu polinucleotidele sintetice(poli-A, poli-C, poli-U), dar nu reactioneaza cu ADN nativ si nici cu ADN denaturat.
3. Imunizarea cu conjugate haptena-proteina,m care haptena este reprezentata de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide, nucleotide, dinucleotide si trinucleotide. Anticorpii sintetizati reactioneaza atat cu haptena cat si cu ADN nativ sau denaturat.
4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici si albumina metilata. Cele doua molecule formeaza un complex necovalent, datorita interactiei dintre gruparile negative ale acizilor nucleici si cele pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetizati reactioneaza cu complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ si denaturat de diferite origini.
5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gasesc in sangele pacientilor cu lupus eritematos diseminat (LED).
Anticorpii sintetizati fata de acizii nucleici cu rol de haptene in conjugatele cu proteine nu au specificitate, deoarece precipita ADN monocatenar, ARN de diferite origini, poliribonucleotide si acizii nucleici dublu catenari.
Lipidele sunt molecule neimunogene in stare nativa, dar se pot cupla cu proteinele si in conjugatul format au rolul de haptene. Din punct de vedere imunologic, cele mai importante lipide sunt fosfatidele (sfingomielina si cefalina) si glicosfingolipidele(galactocerebrozida).
O haptena lipidica cu o importanta practica deosebita este cardiolipina, din cordul mamiferelor. In sangele indivizilor infectati cu T. pallidum se gasesc anticorpi care reactioneaza cu cardiolipina inalt purificata (reactie incrucisata), extrasa din cordul bovin.
Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al sintezei anticorpilor hemaglutinanti si in prezenta complementului, hemolitici.
Studiul imunogenitatii lipidelor a fost ingreunat de insolubilitatea lor in apa. Problema reactivitatii anticorpilor cu antigenele lipidice a fost depasita partial, prin utilizarea lipidelor auxiliare (lecitina si colesterolul) in suspensia antigenica. Disponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitatii lipidelor asociate cu membranele.
Haptene
Haptene le(/7apte/n, grec = a apuca) sunt substante chimice naturale sau de sinteza, cu molecula mica, a caror imunogenitate este conditionata de cuplarea cu o molecula purtator, dar isi pastreaza proprietatea de specificitate, adica reactioneaza cu anticorpii specifici a caror sinteza a fost indusa de haptena conjugata cu o molecula cu rol de purtator.
Denumirea de "haptena" a fost introdusa de Landsteiner pentru a caracteriza din punct de vedere functional un extract alcoolic de rinichi de cal, neimunogen ca atare pentru iepure, dar capabil sa se combine cu anticorpii sintetizati dupa imunizarea iepurelui cu extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o molecula purtator. El a propus ca in categoria haptenelor sa fie cuprinsa orice substanta naturala sau sintetica, cu greutate moleculara mica sau mare, care in forma nativa nu poate sa induca un raspuns imun detectabil, dar dobandeste capacitatea imunogena, dupa cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o molecula purtator cu greutate moleculara mare. Conjugatul este imunogen nu numai in raport cu epitopii moleculei purtator, ci si cu epitopul haptenei.
Din punct de vedere functional, haptenele s-au numit "jumatati de antigene", deoarece au numai una din cele doua proprietati esentiale ale antigenelor: nu sunt imunogene, dar isi pastreaza proprietatea de specificitate. De aceea, termenul "antigenic" nu este sinonim cu cel de "imunogenic". Haptena este un antigen, dar in forma sa nativa, nu este imunogena.
in general, haptenele sunt molecule mici, desi uneori, macromoleculele pot functiona ca haptene. Extractul alcoolic de rinichi de cal este o haptena complexa. Haptenele simple sunt reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele medicamente etc.
Utilizand haptenele simple, prin reactii de cuplare cu o molecula purtator s-au obtinut antigene artificiale. Haptena din complexul molecular are rolul gruparii determinante de specificitate. Studiul imunogenitatii conjugatelor haptena-molecula purtator a permis determinarea marimii gruparilor determinante de specificitate ale antigenelor si indirect, determinarea situsului de combinare a anticorpilor. Pe aceiasi cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea si heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru studiile de cristalografie cu raze X a unui complex antigen-anticorp.
Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate moleculara mica, a caror particularitate consta in aceea ca, dupa injectare, in organism se combina spontan cu proteinele tisulare si formeaza conjugate haptena-proteina, in vivo. Conjugatele haptena-proteina induc sinteza anticorpilor si determina procese de hipersensibilitate sau initiaza maladii autoimune. Astfel se comporta derivatii dinitrofenolului substituiti cu clor sau fluor, unii produsi de degradare a penicilinei.
Antigenele corpusculare
Antigenele corpusculare sunt, in esenta, antigene moleculare asociate virusurilor si celulelor. Proteinele capsidale si glicoproteinele invelisului viral sau proteinele prezentate pe suprafata celulelor infectate cu virusuri, sunt foarte imunogene si stimuleaza raspunsul imun al gazdei. De aceea, imunitatea consecutiva infectiei virale este, de obicei, de lunga durata.
Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate in mediul extracelular), fie corpusculare (legate de celula). Din prima categorie fac parte exotoxinele si polizaharidele capsulare libere, iar din cea de a ll-a, antigenul somatic O (endotoxina bacteriilor Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix, flagelina, pilina, acizii teichoici, mureina etc.
Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafetei eritrocitare, cu determinism biochimic cunoscut, in sistemul A, B, 0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gasesc si pe suprafata celulelor tisulare, dar si in secretiile exocrine (saliva, suc gastric etc), la circa 75% dintre indivizi, denumiti "secretori". Glicoproteinele din secretii sunt hidrosolubile si studiul lor a fost mai usor decat al moleculelor eritrocitare.
Gruparile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare au rol dominant in determinarea specificitatii de grup sanguin, asa cum au evidentiat studiile de digestie enzimatica controlata. Eritrocitele tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun - antigenul H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafata antigenelor de grup 0 si in cantitati progresiv descrescande pe hematiile de grup A, B si AB.
Specificitatea antigenica de grup 0 este conferita de L-fucoza. Grupul A are o gena ce codifica sinteza glicozil-transferazei, enzima ce adauga N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminala a moleculei H. De aceea, specificitatea antigenica a eritrocitelor de grup A este conferita de trizaharidul N-acetil-galactozamina, galactoza si L-fucoza:
N-acetil galactozamina (a 1-3) Gal - R (R = restul catenei polizaharidice) a 1-2 Fuc
Indivizii de grup B au o gena ce adauga D-galactoza (in loc de N-acetil galactozamina) la galactoza preterminala a moleculei H, avand un determinant antigenic format din doua resturi terminale de D-galactoza si L-fucoza.
F/g. 3. Oligozaharidele cu rol de epitopi determinanti ai grupelor sanguine ABO. Oligozaharidul este ancorat in membrana eritrocitului prin intermediul sfingomielinei, denumita ceramida. 85% din indivizii umani secreta substantele de grup sanguin in saliva. La indivizii "secretari", oligozaharidele sunt prezente sub forma conjugatelor cu polipeptidele codificate de genele secretoare (dupa Roitt, 1997).
Prezenta restului de fucoza (adica antigenul H) este esentiala pentru expresia epitopilor A si B. Gena H si antigenul sau lipsesc la fenotipul Bombay. De aceea, transferazele A si B nu pot adauga glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului si antigenele de grup A si B nu sunt exprimate.
Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificata prin tratamentul in vitro cu glicozidaze: o a-glicozidaza (extrasa din bobul de cafea verde) poate diva restul de Gal de pe hematiile de grup B si le converteste in hematii de grup 0, ce pot ramane functionale dupa transfuzia la subiectii de grup 0.
Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset, 1958) sunt molecule de suprafata ale majoritatii tesuturilor. Din punct de vedere biochimic, ele sunt strict specifice fiecarui organism uman si animal si confera individualitate biochimica proprie fiecarui organism. Se numesc si antigene de transplantare, deoarece, dupa grefarea unui tesut sau a unui organ, moleculele de histocompatibilitate se comporta ca antigene si declanseaza raspunsul imun al organismului receptor, care determina respingerea grefei.
Antigenele individuale de histocompatibilitate se evidentiaza prin reactia de respingere a grefei. in functie de raportul genetic dintre donor si receptor, antigenele de histocompatibilitate apartin urmatoarelor categorii:
1) autoantigenele includ antigenele proprii de histocompatibilitate, care, in conditii normale sunt tolerate de sistemul imunitar. Sub actiunea unor factori fizici, chimici sau biologici, antigenele de histocompatibilitate se modifica devenind autoantigene, generatoare ale conflictelor autoimune;
2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune orga-nismelor identice din punct de vedere genetic, care apartin unei linii genetic pure (inbred). Verificarea puritatii genetice a unei populatii de organisme se face prin transplantul de piele. Daca grefa este acceptata, organismele respective apartin aceleiasi linii inbred. Termenii "izoantigen" si "inbred" nu au corespondenta pentru populatia umana;
3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dupa injectare declanseaza raspunsul imun la organisme ale aceleiasi specii, dar diferite genetic, de organismul donor. Aloantigenele sunt inegal raspandite la indivizii unei specii si induc raspunsul imun la organismele care nu poseda antigenul respectiv. Aloantigenele se evidentiaza dupa imunizarea unui organism, cu o suspensie celulara provenita de la organisme ale aceleiasi specii, dar apartinand unui alotip diferit;
4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strain) includ molecule care se gasesc in/pe celulele tuturor indivizilor unei specii si care se comporta ca antigene fata de organismele altei specii. Heteroantigenele se evidentiaza prin sinteza anticorpilor fata de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii diferite.
Celulele unei specii diferite aduc in organismul receptor nu numai heteroantigene, ci si aloantigene si chiar autoantigene. De aceea injectarea unui heteroantigen este una dintre cele mai utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor.
Antigenele de organ sunt molecule specifice care confera particularitatile biochimice si functionale ale celulelor unui organ. De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare difera de proteinele tesutului renal al aceluiasi organism.
Antigene artificiale
La origine, antigenele artificiale sunt antigene naturale, modificate chimic prin cuplarea, cel mai adesea covalenta, cu una sau mai multe specificitate de combinare cu anticorpii, in raport cu molecula de origine. Antigenele artificiale s-au obtinut, in principal, pornind de la moleculele proteice. Prin legarea moleculelor proteice cu diferite haptene s-au obtinut trei tipuri de antigene artificiale: a) conjugate haptena-proteina, prin reactia de diazotare, iodurare si respectiv substitutie nucleofila; b) conjugate proteina-proteina, prin intermediul unor agenti bifunc-tionali de legare (diizocianatii si carbodiimidele); c) proteine legate de suporturi insolubile, prin reactia de diazotare sau prin intermediul carbodiimidelor. a) Conjugatele haptena-proteina au fost utilizate de Landsteiner, in studiile cu privire la mecanismele raspunsului imun. In conjugate, haptenele indeplinesc rolul de epitopi (grupari determinate de specificitate), iar mole-culele proteice au rolul de carrier. Raspunsul imun nu este orientat strict fata de epitopii haptenici, ci si fata de determinanti antigenici ai gruparii carrier.
Cuplarea haptena-purtator necesita existenta unei grupari reactive a haptenei, care sa se lege covalent cu gruparile functionale ale purtatorului, cu conditia pastrarii integritatii functionale a celor doi reactanti. Haptenele se pot cupla cu purtatori foarte diversi, dar proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeaza conjugate foarte imunogene.
Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule proteice, prin reactia de diazotare si a obtinut azoproteine:
Dupa cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei proteine, rezulta un antigen artificial care induce formarea a doua categorii de anticorpi cu specificitati diferite, dupa cum reactioneaza cu haptena, sau cu molecula purtator.
Conjugatele azoproteice au permis studiul influentei configuratiei spatiale a haptenei, asupra specificitatii antigenice. Gruparea sulfonat a fost legata in pozitia orto, meta sau para a haptenei aminobenzen. Antiserurile obtinute au specificitate fata de fiecare izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu proteina, pastreaza capacitatea de a precipita cu anticorpii specifici fata de proteina nativa, in timp ce conjugatele cu izomerii orto- si para- dau reactie foarte slaba de precipitare. Concluzia este ca izomerii de pozitie induc modificari sterice (conformationale) ale haptenei.
Conjugatele haptena-proteina se pot obtine prin reactia de iodurare. Proteinele puternic iodurate isi modifica specificitatea antigenica. Ele induc sinteza anticorpilor care dau reactii incrucisate de precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnificatia este ca prin iodurare, proteinele isi pierd specificitatea antigenica. Toate proteinele iodurate induc sinteza anticorpilor fata de o grupare iodurata, in special fata de tirozina iodurata, indiferent de specificitatea gruparii purtator.
O alta reactie de obtinere a conjugatului haptena-proteina este cea de substitutie nucleofila. Cele mai folosite haptene sunt 2,4-dinitrofenolul(DNP) si 2,4,6-trinitrofenolul(TNP).
Mecanismul molecular al cuplarii este urmatorul: un atom de H din gruparea OH" , NH24" sau S-SH a proteinei, este inlocuit de gruparea haptenica prin eliminarea apei. Proteina pierde electroni, iar nucleul benzenic ii accepta. Gruparile donoare de electroni sunt OH" , NH2"1", S-SH. Gruparile DNP si TNP sunt cuplate cu proteina purtator sub forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a
2,4,6-trinitrobenzen-sulfonatului de Na sau sub forma derivatilor halogenati.
Reactia dintre o proteina si 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu ilustreaza mecanismul atacului nucleofilic, reactie in care proteina cedeaza electroni, iar nucleul benzenic ii accepta. b) Conjugatele proteina-proteina se obtin prin intermediul agentilor bifunctionali de legare: diizocianatii si carbodiimidele. Deoarece gruparile ciano au reactivitate diferita, reactia de cuplare se realizeaza in trepte. De exemplu, gruparea din pozitia 4 a toluilen-diizocianatului este mai reactiva decat gruparea ciano din pozitia 2. Aceasta permite ca una dintre proteine sa se cupleze in pozitia 4, iar ulterior, intr-o noua etapa a reactiei, cea de a ll-a proteina se va cupla la gruparea ciano din pozitia Agentii bifunctionali de cuplare permit obtinerea conjugatelor proteice (conjugate anticorpi-feritina, insulina-albumina), dar se folosesc si ca mediatori ai legarii diferitelor molecule proteice pe suprafata eritrocitelor.
Marcajul cu feritina este deosebit de important din punct de vedere practic, deoarece se foloseste pentru evidentierea electrono-optica, la nivelul membranei, a diferitelor molecule proteice. c) Conjugatele proteina-suport insolubil se obtin prin cuplarea proteinelor cu un suport insolubil, prin reactia de diazotare, prin intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se folosesc derivati celulozici: sephadex, sepharoza, agaroza etc. Legarea proteinei de suport, prin reactia de diazotare, se face prin intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau argininei.
Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbenti si sunt folositi cu o eficienta deosebita pentru purificarea proteinelor dintr-un amestec, datorita specificitatii lor de combinare cu anticorpii corespunzatori, fixati intr-o coloana de material inert. Antigenul complementar specificitatii de legare a anticorpului fixat in coloana, se leaga necovalent de imunosorbent, dupa care poate fi eluat cu un agent chimic.
Anticorpii pot fi imobilizati pe un suport insolubil, prin tratamentul cu un agent de legare incrucisata (glutaraldehida), dar multe din situsurile reactive pt fi denaturate sau raman ascunse.
Cel mai bun suport de imobilizare este agaroza, un polizaharid obtinut prin fractionarea agarului. Agaroza este rezistenta la actiunea degradativa a enzimelor bacteriene si a agentilor chimici si poate fi regenerata. Este disponibila sub forma sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 u,m si contine 2-8% agaroza in solutie apoasa.
In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci si antigenele sau chiar celule intacte.
Imunosorbentii se folosesc in activitatea de cercetare si in clinica, pentru prepararea unor produse biologice si a medicamentelor.
Antigene sintetice
Antigenele sintetice sunt polimeri de aminoacizi, cu secventa cunoscuta, obtinuti in vitro. Proprietatile imunogenice ale homopolimerilor (poli-Lys, poli-Glu, poli-Pro) si ale heteropolimerilor au fost studiate de M. Sela. Studiul imunogenitatii heteropolimerilor are avantajul ca ofera posibilitatea studiului influentei compozitiei chimice, a greutatii moleculare si a conformatiei moleculare, usurand studiul imunochimic al gruparilor determinante de specificitate antigenica.
Catenele polipeptidice sintetice pot fi lineare sau ramificate. Cele ramificate rezulta prin atasarea polimerilor lineari, la o catena polifunctionala. Ramificarea se obtine mai usor cu aminoacizi aromatici.
Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu exceptia poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, poli-L-Lys. Copolimerii formati din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultati prin polimerizarea a trei aminoacizi diferiti sunt totdeauna imunogeni. Cu cat compozitia lor este mai heterogena, imunogenitatea este mai accentuata. Prezenta aminoacizilor aromatici confera o anumita rigiditate a epitopilor si implicit, o imunogenitate superioara.
Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie sa fie catabolizati de aparatul enzimatic al celulelor care prelucreaza si prezinta antigenul. Polipeptidele formate din D-aminoacizi sunt slab imunogene, datorita incapacitatii organismului de a cataboliza polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile in studiile de imunochimie, cu privire la:
-determinarea marimii gruparii determinante de specificitate si indirect, a situsului de combinare a anticorpilor specifici;
-rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietatilor de imunogenitate;
-rolul configuratiei spatiale a moleculei in conferirea proprietatii de imunogenitate;
-identificarea epitopilor secventiali si conformationali.
Determinantii antigenici
De cele mai multe ori, antigenele sunt macromolecule complexe sau chiar celule intregi, dar raspunsul imun, dupa injectarea lor in organism, este orientat predominant fata de situsuri discrete, strict limitate ale antigenului, denumite grupari determinante de specificitate (gds), situsuri antigenice, determinanti antigenici sau epitopi.
Epitopul este regiunea limitata a antigenului care induce un raspuns imun specific, se combina cu situsul activ al moleculei de anticorp si determina specificitatea reactiei antigen-anticorp.
Antigenele proteice prezinta cea mai mare diversitate de epitopi, atat in privinta compozitiei chimice, cat si a configuratiei spatiale. Studiile de cristalografie cu raze X permit identificarea atomilor individuali ai unei molecule si determinarea mobilitatii lor, exprimata in factori de temperatura atomica. Factorii de temperatura ridicata corespund regiunilor moleculare cu mobilitate inalta (regiuni calde). In molecula proteica, epitopii corespund zonelor moleculare cu o mobilitate inalta a atomilor. La temperatura biologica, aceste secvente necesita cantitati mici de energie, pentru a trece dintr-o conformatie in alta. Invers, regiunile moleculare cu mobilitate atomica redusa au factori termici de valoare scazuta (regiuni reci) si necesita o cantitate mai mare de energie pentru schimbarea conformatiei. Adeseori, epitopii antigenici sunt localizati in regiunile calde ale moleculei.
Capacitatea unei regiuni a moleculei de antigen de a functiona ca epitop (adica de a stimula raspunsul imun) se numeste imunopotenta.
Marimea gruparii determinante de specificitate s-a apreciat indirect prin determinarea marimii haptenei capabila sa "umpla" complet situsul de combinare al anticorpului. in acest scop s-a utilizat sistemul dextran-antidextran, intr-o reactie de precipitare. Dextranul cu greutate moleculara de 50 kD este imunogen si prin injectare repetata la iepure, se obtine serul imun anti-dextran. Artificial se prepara oligozaharide cu dimensiuni controlabile. Reactia de precipitare dextran-anticorpi specifici este inhibata progresiv de oligozaharidul de glucoza si este completa in prezenta hexazaharidului. Oligomerul cu 6 resturi de glucoza corespunde celui mai bun ligand care se cupleaza cu anticorpii anti-dextran (ligandul este orice molecula capabila sa formeze un complex cu o alta molecula). Heptazaharidul, ca si oligozaharidele cu mai putin de 6 resturi de glucoza inhiba mai putin eficient reactia de precipitare a sistemului dextran-antidextran.
Cercetari similare s-au facut cu homopolimeri de aminoacizi (poli-Lys, poli-Ala), legati de proteine purtator. Serul imun obtinut pe iepure, fata de aceste conjugate, contine predominant anticorpi specifici fata de haptena homopolimerica. Reactia de precipitare dintre serul specific si conjugatul haptena-proteina, este inhibata de pentamerul de alanina, ceea ce denota ca acesta se leaga cu cea mai mare afinitate de situsul de combinare al anticorpului. Pentamerul corespunde marimii epitopului antigenic al conjugatului si reflecta, indirect, marimea situsului de combinare al anticorpilor specifici.
in concluzie, marimea unui epitop polizaharidic corespunde la 6-8 unitati monomerice, iar pentru antigenele proteice, epitopul are 4-6 aminoacizi.
Valenta antigenului s-a definit conventional prin numarul de epitopi ai unui antigen. Numarul de epitopi ai unei molecule antigenice variaza in raport cu marimea si complexitatea sa structurala.
Valenta se evalueaza prin numarul moleculelor de anticorp care reactioneaza cu o molecula de antigen. Pentru evaluarea numarului de epitopi ai unui antigen, trebuie avut in vedere ca molecula de anticorp este bivalenta (leaga doi epitopi), dar si faptul ca un antiser nu contine anticorpi fata de toti epitopii unui antigen.
Studiile privind reactia antigen-anticorp in vitro, au condus la concluzia existentei a trei tipuri de valente antigenice (epitopi):
-valentele functionale conformationale sunt conferite de epitopii conformationali, situati la suprafata moleculei native de antigen si sunt accesibili sistemelor imunitare de recunoastere specifica a moleculei. Numarul lor este proportional cu greutatea moleculara a antigenului si este dependent de complexitatea conformationala a moleculei. Un situs antigenic, teoretic, s-ar gasi la fiecare cateva mii de daltoni;
-valentele functionale interne sunt reprezentate de epitopi interni, care, in molecula nativa sunt inaccesibile sistemului imunitar. Ele devin functionale, in vivo, dupa degradarea partiala a moleculei, in celulele care prelucreaza antigenul;
-valente nefunctionale, reprezentate de epitopi criptici care nu devin functionale dupa prelucrarea antigenului in vivo, dar se pot releva dupa clivarea enzimatica in vitro a moleculei.
Numarul total al epitopilor unui antigen nu se cunoaste, dar se poate evalua cu aproximatie, dupa degradarea partiala a moleculei de antigen. De exemplu, albumina serica bovina nativa are 6 situsuri functionale conformationale. Dupa scindarea enzimatica menajata in vitro, rezulta 9 fragmente peptidice, fiecare dintre ele dand reactie de precipitare cu serul anti-albumina nativa. Pentru ca reactia de precipitare sa aiba loc, sunt necesari cel putin doi epitopi, ceea ce inseamna ca molecula de albumina serica bovina are cel putin 18 epitopi, care devin functionali dupa scindarea enzimatica a moleculei si induc sinteza anticorpilor specifici.
Efectul de carrier
Antigenele prezinta o dualitate functionala evidenta, conferita de faptul ca specificitatea raspunsului imun este orientata predominant, dar nu exclusiv, fata de gruparile determinante de specificitate. La randul sau, suportul macromolecular (carrier) are proprietatea de imunogenitate, dar confera si un grad de specificitate a raspunsului imun. Rezultatele experimentale cu conju-gate haptena-proteina (dinitrofenol-albumina serica) au evidentiat ca in cazul in care suportul carrier este nonself, raspunsul imun este mai intens. Antigenul artificial s-a obtinut prin cuplarea DNP cu albumina de soarece. Injectarea conjugatului la soarece induce un raspuns imun slab, cu un titru scazut al anticorpilor anti-DNP(anti-haptena). Conjugatul DNP-albumina serica bovina, injectat la soarece, stimuleaza intens raspunsul imun primar anti-haptena, ceea ce demonstreaza ca gruparea carrier are rol modulator asupra raspunsului imun.
Rolul gruparii carrier in reactivitatea imunitara a fost evidentiat prin evaluarea titrului anticorpilor dupa stimularea secundara. Animalele stimulate repetat cu haptena A, cuplata cu purtatorul B, produc un raspuns imun secundar intens, cu anticorpi anti-haptena si anti-carrier. insa, in raspunsul imun secundar, daca stimularea s-a facut cu haptena A, cuplata cu un carrier diferit (C) titrul anticorpilor anti-haptena nu creste. Acest fenomen curios s-a denumit "efect de carrier".
Un purtator eficient pentru stimularea raspunsului imun trebuie sa fie imunogenic, adica sa stimuleze raspunsul celulelor T. Moleculele neimunogene sunt purtatori ineficienti ai haptenelor, pentru stimularea raspunsului imun. Aceasta arata ca mecanismele de recunoastere pentru haptena si pentru gruparea purtator sunt diferite.
Imunizarea cu conjugate haptena-carrier, a indus numai sinteza anticorpilor specifici anti-haptena, daca purtatorul a fost un antigen T-dependent. Moleculele neimunogene nu au calitati de carrier pentru haptene.
"Efectul de carrier" denota ca haptena si epitopii purtatorului sunt recunoscuti separat, de limfocitele B si respectiv T. Cele doua subpopulatii de celule coopereaza pentru a induce sinteza anticorpilor cu specificitate de haptena.
FACTORII CARE CONDITIONEAZA IMUNOGENITATEA
Antigenul este o substanta nonself, care, la contactul cu celulele sistemului imunitar, declanseaza sinteza anticorpilor specifici si a receptorilor celulari cu care se combina in vitro si in vivo. Definitia este nesatisfacatoare, pentru ca se refera la ce face antigenul, fara sa-l defineasca in termeni proprii. Definirea completa a antigenului este rezultatul insumarii unei serii de proprietati, fiecare dintre ele fiind o conditie necesara a imunogenitatii, dar nu si suficienta.
Conditiile imunogenitatii au fost deduse prin studii experimentale, utilizand antigene artificiale si sintetice.
1. Caracterul strain al moleculei este conditia majora a imunogenitatii. O molecula nonself este cu atat mai imunogena, cu cat este mai diferita de moleculele organismului receptor. In esenta, caracterul nonself al unei molecule nu este strict dependent de raporturile taxonomice ale organismului donor cu cel receptor de antigen, ci este consecinta deosebirilor de structura moleculara.
Cele mai multe proteine ale unei specii sunt nonself pentru alte specii, dar uneori, proteinele omologe ale unor specii sunt lipsite reciproc de imunogenitate. De exemplu, hemoglobina de cal nu este imunogena pentru iepure, desi celelalte proteine de cal sunt imunogene. Caracterul nonself nu implica in mod obligatoriu existenta unor molecule cu totul noi, neintalnite la organismul receptor, ci numai modificari minime ale moleculei, conferite de existenta catorva aminoacizi diferiti in anumite pozitii ale catenei proteice. Pentru restul secventei, molecula nonself poate fi asemanatoare proteinelor proprii organismului receptor de antigen. Micile diferente de secventa a aminoacizilor, au rolul de epitopi. De regula, proteinele aparute timpuriu in evolutie au un grad superior de asemanare chimica interspecifica si sunt slab imunogene pentru speciile inrudite (de exemplu, albumina serica), iar cele aparute mai tarziu (de exemplu, globulinele serice) sunt mai heterogene si mai imunogene.
2. Marimea moleculei influenteaza imunogenitatea moleculelor nonself. Pentru a fi imunogena, o molecula trebuie sa aiba dimensiuni care sa depaseasca un prag limita. Moleculele cu o buna imunogenitate sunt mai mari de 10 kD. Cu cat o molecula este mai mare, cu atat numarul epitopilor sai este mai mare. Secventele de aminoacizi cu rol de epitopi au sansa repetarii de mai multe ori intr-o molecula mai mare. Proteinele mari (de exemplu, ovalbumina - 40 kD, albumina serica - 70 kD, hemocianina - 6000 kD) sunt foarte imunogene, iar cele cu molecula mica (insulina - 5,7 kD, histonele - 6 kd, glucagonul - 3,5 kD) sunt putin imunogene. Glucagonul este cea mai mica molecula naturala fata de care s-au obtinut anticorpi, iar cea mai mica molecula sintetica imunogena este un polipeptid de 1,4 kD.
Pentru polizaharide, limitele minime pentru imunogenitate sunt mai mari. Dextranii sunt antigenici daca au peste 50 kD, cu variatii mari de raspuns imun de la o specie la alta (omul si soarecele raspund bine, cobaiul - foarte putin).
Moleculele mici neimunogene sau slab imunogene pot dobandi o imunogenitate optima, dupa adsorbtia pe particule inerte de colodiu, caolin sau de carbune. Acestea au rol de purtatori si asigura cresterea taliei moleculare.
3. Complexitatea moleculara. Dimensiunile mari ale unei molecule nonself nu sunt totdeauna suficiente pentru a-i conferi imunogenitate. De exemplu, moleculele de polimeri sintetici (poli-acrilamida, nylonul) sunt foarte mari, fiind formate dintr-un numar mare de monomeri repetitivi, dar nu sunt imunogene pentru ca nu au complexitatea moleculara minima necesara.
Moleculele naturale, in special proteinele au un grad inalt de complexitate, datorita diversitatii monomerilor componenti. Fiecare tip de molecula proteica are o configuratie tridimensionala unica, determinata de secventa specifica de aminoacizi.
Proteinele globulare au cea mai mare complexitate antigenica, derivata din configuratia lor tertiara. Ele poseda epitopi exprimati pe suprafata moleculei native, accesibili fenomenului de recunoastere de catre celulele sistemului imunitar si epitopi interni, care pot stimula raspunsul imun, dupa clivarea enzimatica a moleculei in celulele specializate pentru prelucrarea antigenelor. De exemplu, serul imun anti- albumina serica bovina precipita cu fiecare din cele 9 fragmente peptidice rezultate prin clivajul enzimatic al moleculei native, ceea ce sugereaza ca in vivo, molecula este scindata si astfel se releva epitopi interni, fata de care se sintetizeaza anticorpi specifici.
Complexitatea unei molecule nu depinde numai de diversitatea monomerilor, ci si de secventa lor si de efectul secventei asupra structurii secundare, tertiare si eventual quaternare a moleculei.
4. Starea fizica a antigenului. Imunogenitatea unei molecule este conditionata de o anumita rigiditate a epitopilor sai. Lipsa rigiditatii ar explica imunogenitatea redusa a gelatinei, o proteina denaturata, derivata din hidroliza colagenului, foarte bogata in glicocol (21-35%).
in mod obisnuit, rotatia libera a unei molecule are loc numai intre C a si legatura peptidica. Glicocolul nu realizeaza ramificatii ale catenei polipeptidice in pozitia C a, ceea ce face ca molecula de gelatina sa prezinte rotatii libere in jurul axului longitudinal. Gelatina are o proportie foarte mica de aminoacizi aromatici (Tir, His), iar cisteina si triptofanul lipsesc. Legarea
L-Tir, in proportie de 2% mareste gradul de imunogenitate a gelatinei. Complexul induce sinteza anticorpilor care precipita gelatina nativa.
5. Solubilitatea. Conditia solubilitatii unui antigen pentru a fi imunogen este sugerata de urmatarele observatii:
-polimerii macromoleculari sintetici care nu sunt solubilizati, adica nu sunt hidrolizati, sunt lipsiti de imunogenitate;
-organismele cu echipamente enzimatice hidrolitice mai active (soarece) elaboreaza un raspuns imun mai amplu fata de un antigen greu solubil(de exemplu, polizaharidul de pneumococ), in raport cu organismele care hidrolizeaza mai greu (de exemplu, iepurele);
-antigenele corpusculare (celule, virioni) devin imunogene dupa solubilizarea si eliberarea componentelor imunogene in macrofag, unde are loc degradarea menajata a antigenelor.
Hidroliza enzimatica a antigenului nu este totdeauna o conditie prealabila obligatorie a imunogenitatii. Studiile cu antigene sintetice au aratat ca, in momentul recunoasterii de catre celulele sistemului imunitar, o parte a epitopiior sunt intacti, identici cu aceia ai moleculei native.
6. Accesibilitatea determinantilor antigenici. Pentru ca un epitop sa fie imunogen, trebuie sa fie expus la suprafata moleculei, pentru a fi accesibil mecanismelor de recunoastere imunitara. De exemplu, un polimer de L-Lys, cu rol de purtator pentru tripeptidui Tir-Ala-Glu este imunogen. Dupa mascarea epitopiior tripeptidici cu catene de poli-Ala, molecula isi pierde imunogenitatea.
7. Configuratia spatiala a moleculei este un factor decisiv pentru imunogeneza. Studiile privind imunogenitatea antigenelor sintetice, au evidentiat ca cel mai adesea, anticorpii se formeaza fata de o anumita secventa de aminoacizi, care are rol de epitop. Dar, uneori, anticorpii sunt specifici fata de configuratia spatiala a unui determinant antigenic. Concluzia a reiesit din specificitatea distincta a anticorpilor fata de doua polipeptide sintetice cu aceiasi compozitie chimica, dar cu configuratii spatiale diferite. In primul caz, determinantul antigenic este tripeptidui Tir-Ala-Glu, legat de un polimer sintetic, cu rol de purtator. La iepure, se sintetizeaza anticorpi specifici fata de tripeptidui Tir-Ala-Glu.
in al ll-lea caz, prin polimerizarea tripeptidului se obtine o molecula cu structura periodica a secventei Tir-Ala-Glu, care dobandeste configuratie a-helicala. Dupa imunizarea iepurelui, se sintetizeaza anticorpi care precipita moleculele cu structura spatiala a-helicala, dar nu precipita tripeptidul simplu. Pe baza acestor observatii, M. Sela recunoaste existenta a doua tipuri de determinanti antigenici:
-determinanti secventiali, a caror specificitate este data de secventa subunitatilor componente (aminoacizi, monozaharide), indiferent de structura spatiala a moleculei. Epitopii secventiali sunt comuni pentru toate polipeptidele care au secvente de aminoacizi identice sau asemanatoare si existenta lor este o sursa a reactiilor imune incrucisate;
-determinanti antigenici conformationali, a caror specificitate deriva din configuratia spatiala a moleculei. Epitopii conformationali sunt de doua feluri: continui si discontinui. Cei discontinui sunt formati din regiuni distincte ale moleculei, care ajung in juxtapozitie cand molecula se pliaza in configuratia sa nativa.
Mentinerea integritatii determinantilor conforma-tionali este conditionata de integritatea legaturilor S-S. Dupa fragmentarea enzima-tica a moleculei, epitopii conformationali discontinui isi pierd integritatea si semnificatia functionala, iar cei continui au o soarta variabila: isi pierd sau isi pastreaza configuratia avuta in molecula nativa.
Importanta epitopilor conformationali a fost evi-dentiata pentru molecula de lizozim din albusul de ou de gaina. Bucla formata de aminacizii 64-80 este inchisa de o legatura S-S intre doua resturi de cisteina. Secventa buclei a fost sintetizata artificial si legata de polimerul
Ala-Lys, cu rol de carrier. Complexul format induce sinteza anticorpilor la iepure, specifici fata de aceasta secventa, dar dau reactie de precipitare si cu molecula nativa de lizozim.
in general, anticorpii care se sintetizeaza fata de antigenele proteice naturale au specificitate, in primul rand, fata de epitopii conformationali si mai rar fata de cei secventiali, ceea ce denota ca sistemul imunitar recunoaste molecula nativa sau regiuni ale ei, cu configuratia spatiala initiala.
in concluzie, studiul antigenelor sintetice a avut un rol decisiv pentru definirea conditiilor de imunogenitate. Polizaharidele sunt molecule cu o slaba imunogenitate, corespunzatoare unei complexitati moleculare limitate. Acizii nucleici si lipidele sunt molecule neimunogene in stare nativa, dar dupa cuplarea cu un suport proteic, indeplinesc rolul de haptene si devin foarte imunogene. Din aceasta cauza, nucleoproteinele si lipoproteinele sunt antigene foarte eficiente. Proteinele native sunt imunogene, dar pentru exprimarea la un nivel superior a acestei proprietati, trebuie sa indeplineasca conditiile enumerate. Acestea, luate in parte, sunt necesare, dar nu suficiente. O buna imunogenitate este rezultatul cumularii unui numar cat mai mare de conditii.
Un antigen ideal trebuie sa fie greu degradabil (pentru o persistenta cat mai lunga in organism), sa fie timodependent si sa aiba un numar cat mai mare de semnale imunogene (epitopi), conectate intr-un ansamblu functional, denumit imunon.
Antigene endogene
Antigenele endogene sunt componente celulare si tisulare proprii (seif), fata de care, in conditii normale, sistemul imunitar nu manifesta reactivitate. Totusi, unele componente tisulare, in anumite conditii, pot sa stimuleze reactivitatea imunitara. Se disting doua categorii de antigene endogene: 1) antigene sechestrate (mascate) si 2) antigene alterate.
Antigenele sechestrate sunt substante cu localizare intracelulara si de aceea nu sunt accesibile sistemului imunitar pentru a fi recunoscute in cursul dezvoltarii ontogenetice. Sub actiunea unor factori (fizici, chimici, biologici), inductori ai unor procese de liza celulara, moleculele cu localizare intracelulara se pot elibera si sunt recunoscute ca nonself de sistemul imunitar. De exemplu, anticorpii antimitocondriali care caracterizeaza ciroza biliara primitiva, se sintetizeaza dupa liza unor celule si eliberarea acestor organite.
Alteori, unele componente tisulare sunt separate de sistemul imunitar, prin bariere anatomice:
-proteinele cristalinului, delimitate de cristaloida, se elibereaza in cursul interventiilor chirurgicale, dupa traumatisme care sparg capsula sau dupa afectiuni care permeabilizeaza cristaloida. Ele sunt recunoscute ca molecule nonself si stimuleaza raspunsul imun anti-cristalin, ce poate afecta irisul, procesele ciliare si coroida;
-proteinele spermatice, in starile de spermostaza, induc sinteza locala a autoanticorpilor in structurile epididimului. Anticorpii recunosc specific un antigen al spermatozoizilor si rezultatul este imobilizarea sau chiar aglutinarea, cu consecinta sa, sterilitatea imunitara;
-caseina din lapte poate stimula reactivitatea autoimunitara.
Antigenele alterate sunt molecule normale ale suprafetei celulare, legate de membrana, care, din diferite cauze(uzura fiziologica sau sub actiunea diferitilor factori - fizici, chimici, biologici) isi modifica structura chimica si sunt recunoscute ca molecule nonself. De exemplu, unele medicamente, dupa legarea cu diferite molecule din plasma sau de pe suprafata eritrocitelor, le modifica conformatia nativa si acestea sunt recunoscute ca nonself. Virusurile induc sinteza in celula infectata, a antigenelor proprii, dar adeseori moleculele specific virale determina modificarea unor molecule seif, care sunt recunoscute ca molecule straine si initiaza conflictul autoimun.
in conditii normale, antigenele sechestrate ^ si alterate sunt neutralizate si eliminate, fara consecinte patologice. in 1900, Ehrlich a formulat conceptul "horror autotoxicus", care semnifica preponderenta actiunii mecanismelor homeostatice. In conditiile unei reactivitati imunitare crescute, activarea raspunsului imun fata de aceste componente chimice are drept consecinte, declansarea maladiilor autoimune, considerate ca fiind expresia patologica a functiei imunitare.
Antigene heterofile
Antigenele heterofile sunt substante neidentice, dar inrudite chimic, prezente la numeroase specii de organisme: om, animale, plante, microorganisme. Particularitatea dominanta consta in faptul ca ele induc sinteza anticorpilor care dau reactii incrucisate: anticorpii specifici fata de un antigen al grupului heterofil, reactioneaza (intr-o reactie de precipitare sau de aglutinare) cu oricare dintre antigenele grupului.
Prototipul antigenelor heterofile este antigenul de tip Forssman, descoperit in 1911 in tesuturile de cobai. J. Forssman a descoperit ca serul imun obtinut prin imunizarea iepurelui cu omogenat tisular de cobai, aglutineaza eritrocitele de berbec. Este o reactie incrucisata, pe care autorul a denumit-o reactie heterologa. Termenul "heterolog" s-a pastrat pentru reactiile incrucisate previzibile, pe care le manifesta diferite antigene inrudite (de exemplu, albumina serica de om si de primate). Denumirea "heterofil" s-a atribuit reactiilor incrucisate pe care le produc antigene neinrudite.
Regnul animal poate fi impartit in specii Forssman pozitive (cobai, hamster, soarece, oaie, capra, cal, pisica, caine, pui de gaina etc.) si specii Forssman negative (om, iepure, sobolan, maimute, bou, gasca). Nici unele nici altele nu au vreun grad de inrudire genetica.
Absenta antigenului Forssman pe suprafata celulelor tisulare la iepure, este foarte importanta din punct de vedere practic. Serul imun anti-antigen Forssman se obtine prin imunizarea iepurelui cu o suspensie de hematii de berbec. In contact cu hematiile de berbec, serul imun obtinut pe iepure, produce aglutinarea lor, iar in prezenta complementului se produce liza. Anticorpii specifici fata de antigenele hematiei de berbec dau reactie incrucisata cu antigenele tisulare ale grupului Forssman, dar si cu antigene de origine bacteriana. Antigene de tip Forssman s-au identificat ulterior, prin reactii serologice, in celulele unor bacterii patogene (Str. pneumoniae, Shigella, Salmonella) si chiar in celulele microbiotei din tractul digestiv, ceea ce explica prezenta anticorpilor naturali anti-hematie de berbec, in serul uman.
Reactiile imune incrucisate pe care antigenele de tip Forssman le dau cu serul imun obtinut fata de unul din antigenele grupului se explica prin asemanarea structurii chimice a acestor molecule. Cele mai multe antigene heterofile sunt glicoproteine sau glicolipide, in care gruparile glucidice au rolul de haptene. Componentele glucidice ale antigenelor heterofile sunt foarte asemanatoare din punct de vedere chimic, chiar daca apartin unor organisme cu pozitie sistematica foarte diferita. Antigenul Forssman este un glico-sfingolipid, la care determinantul antigenic este format din doua resturi de N-acetil-galactozamina.
Polizaharidele antigenelor de tip Forssman, in stare purificata, nu sunt imunogene, sunt rezistente la fierbere si chiar la autoclavare.
Cele mai importante sisteme heterofile sunt cele cu semnificatie biologica sau importanta medicala: sistemul Forssman, sistemul Paul-Bunnell (P-B) si sistemul Hanganutziu-Deicher(H-D).
Anticorpii caracteristici mononucleozei infectioase (Paul si Bunnell, 1932) apar la 90% dintre pacientii infectati cu virusul Epstein-Barr si sunt IgM care se evidentiaza intr-o reactie de aglutinare cu eritrocite de ovine sau bovine. Anticorpii serici recunosc doua antigene distincte: un antigen prezent numai pe eritrocitele bovine (B) si un al ll-lea antigen, existent atat pe eritrocitele de bovine cat si pe cele de ovine (BS). Majoritatea pacientilor cu mononucleoza infectioasa sintetizeaza anticorpi anti-B si anti-BS, dar o mica proportie contin numai anticorpi anti-B. Anticorpii P-B se sintetizeaza fata de un antigen, ce pare a fi o glicoproteina codificata de virus.
Anticorpii H-D, descrisi de Hanganutziu (1924) si Deicher (1926) sunt declansatori ai maladiei serului, la pacientii care au primit injectii de ser heterolog. Sinteza lor este indusa de antigenul H-D, care se gaseste in tesuturile mamiferelor, dar lipseste din tesuturile normale umane, insa reapare in unele tesuturi umane patologice (limfoame si mieloame). Din punct de vedere chimic, antigenul H-D e